本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關 液體樣本中肺炎支原體 (MP)水平。
實驗原理：
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定標本中人肺炎支原體 (MP)。用純化 的人肺炎支原體(MP)抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中肺炎支原體 (MP)相結(jié)合， 經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與 HRP 標記的肺炎支原體 (MP)抗體結(jié)合，形成抗 體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn) 化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），與 CUTOFF 值相比較，從而判定標本中人肺炎支原體 (MP)的存在與否。
試劑盒組成：
試劑盒組成 | 48 孔配置 | 96 孔配置 | 保存 |
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說明書 | 1 份 | 1 份 | |
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封板膜 | 2 片（48） | 2 片（96） | |
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密封袋 | 1 個 | 1 個 | |
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酶標包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
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陰性對照 | 0.5ml×1 瓶 | 0.5ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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陽性對照 | 0.5ml×1 瓶 | 0.5ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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酶標試劑 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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樣品稀釋液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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顯色劑 A 液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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顯色劑 B 液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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終止液 | 3ml×1 瓶 | 6ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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濃縮洗滌液 | （20ml×20 倍）×1 瓶 | （20ml×30 倍）×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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樣本處理及要求：
- 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上 清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
- 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次 離心。
- 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程 中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
- 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/ 分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞 濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心 20 分
鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
- 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?nbsp;用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器 將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待 檢測，其余冷凍備用。
- 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上 進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
- 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟：
- 編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照 2 孔、陽性對照 2 孔、空白對照 1 孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）
- 加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照 50μl。然后在待測樣品孔先 加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不 觸及孔壁，輕輕晃動混勻，
- 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
- 配液：將 30（48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至 600ml 后備用
- 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復 5 次，拍干。
- 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。
- 溫育：操作同 3。
- 洗滌：操作同 5。
- 顯色：每孔先加入顯色劑 A 50μl，再加入顯色劑 B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘
- 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
- 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)進行。
結(jié)果判定：
試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10 臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15 陰性判定：樣品 OD 值< 臨界值（CUT OFF）者為肺炎支原體 (MP)陰性 陽性判定：樣品 OD 值≥ 臨界值（CUT OFF）者為肺炎支原體 (MP)陽性
注意事項
1．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未 用完，板條應裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物請避光保存。
6．試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準，使用雙波長檢測時，參考波長為 630nm
7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。終止液為 2M 的硫酸，使用時必須 注意安全。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：2-8℃。
2．有效期：6 個月
