目前，已泛起多種檢測尿中微量白蛋白的方法，如化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法、試條半定量法、免疫比濁法等。 因為腎小球毛細管滲透滲出性和血管壁成分的改變，白蛋白可通過腎小球基底膜滲透滲出到尿液中，尿中白蛋白排泄顯著高于正常，其濃度通常在20~200mg/L之間，于是形成了微量白蛋白尿。近年來很多研究表明尿微量白蛋白不僅是糖尿病腎病的猜測指標(biāo)，也是心血管疾病的獨立危險因素，所以檢測尿微量白蛋白有重要的臨床價值。本文分別用ELISA法和化學(xué)發(fā)光法測定尿微量白蛋白濃度，對其結(jié)果進行比較，并比較其優(yōu)缺點，從而評價ELISA法的臨床合用性。為了上好微生物學(xué)實驗課，并保證安全，特提出如下注意事項：
1．每次實驗前必須對實驗內(nèi)容進行充分預(yù)習(xí)，以了解實驗的目的、原理和方法，做到心中有數(shù)，思路清楚。
2．認(rèn)真及時做好實驗記錄，對于當(dāng)時不能得到結(jié)果而需要連續(xù)觀察的實驗，則需記下每次觀察的現(xiàn)象和結(jié)果，以便分析。
3．實驗室內(nèi)應(yīng)保持整潔，勿高聲談話和隨便走動，保持室內(nèi)安靜。
4．實驗時小心仔細，全部操作應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進行，萬一遇有盛菌試管或瓶不慎打破、皮膚破傷或菌液吸入口中等意外情況發(fā)生時，應(yīng)立即報告指導(dǎo)教師，及時處理，切勿隱瞞。
5．實驗過程中，切勿使酒精、丙酮等易燃藥品接近火焰。如遇火險，應(yīng)先關(guān)掉火源，再用濕布或沙土掩蓋滅火。必要時用滅火機。
6．使用顯微鏡或其他貴重儀器時，要求細心操作，特別愛護。對消耗材料和藥品等要力求節(jié)約，用畢后仍放回原處。
7．每次實驗完畢后，必須把所用儀器抹凈放妥，將實驗室收拾整齊，擦凈桌面，如有菌液污染桌面或其他地方時，可用3％來蘇爾液或5％石炭酸液覆蓋其上半小時后擦去，如系芽孢桿菌，應(yīng)適當(dāng)延長消毒時間。凡帶菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗滌前須浸泡在3％來蘇爾液中進行消毒。
8．每次實驗需進行培養(yǎng)的材料，應(yīng)標(biāo)明自己的組別及處理方法，放于教師的地點進行培養(yǎng)。實驗室中的菌種和物品等，未經(jīng)教師許可，不得攜出室外。
9．每次實驗的結(jié)果，應(yīng)以實事求是的科學(xué)態(tài)度填入報告表格中，力求簡明準(zhǔn)確，并連同思考題及時匯交教師批閱。
10．離實驗室前應(yīng)將手洗凈，注意關(guān)閉門窗、燈、火、煤氣等。試驗原理：ELISA試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知PAFA濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進行檢測。先將PAFA和*標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中PAFA的濃度呈比例關(guān)系。

操作注意事項

1． 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

2． 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

3． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6． 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

7． 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。

8． 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

9． 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

ELISA試劑盒樣品收集、處理及保存方法

1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液

5、 保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作步驟

1． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。

3． 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的*標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

4． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

8． 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。

試劑盒性能

1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細胞因子反應(yīng)。

3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

結(jié) 果 判 斷 與 分 析
1、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的PAFA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的PAFA含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

3、檢測值范圍：0-1600U/L