活體生物發(fā)光成像技術(shù)
 
一、技術(shù)原理
1. 標(biāo)記原理
    哺乳動物生物發(fā)光，一般是將Firefly luciferase基因（由554個氨基酸構(gòu)成，約50KD）即熒光素酶基因整合到預(yù)期觀察的細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株，當(dāng)細胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時, 熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達?；?、細胞和活體動物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。將標(biāo)記好的細胞接種到實驗動物體內(nèi)后，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強度與標(biāo)記細胞的數(shù)目線性相關(guān)。
 
    除Firefly Luciferase外，有時也會用到Renilla Luciferase。二者的底物不一樣，前者的底物是熒光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光波長不一樣，前者所發(fā)的光波長在540~600nm，后者所發(fā)的光波長在460~540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快，而且特異性沒有前者好，所以大部分活體實驗使用Firefly Luciferase作為報告基因，如果需要雙標(biāo)記，也可采用后者作為備選方案。
 
    熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素。熒光素在氧氣、ATP存在的條件下和熒光素酶發(fā)生反應(yīng)，生成氧化熒光素(oxyluciferin)，并產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。
 
    對于細菌標(biāo)記，一般利用發(fā)光酶基因操縱子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。利用這種辦法進行標(biāo)記的細菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。但是一般細菌標(biāo)記需要轉(zhuǎn)座子的幫助把外源基因插入到細菌染色體內(nèi)穩(wěn)定表達。
 
2. 底物熒光素的特點
    熒光素由于諸多優(yōu)點得到廣大科研人員的青睞，主要特點如下：
(1) 熒光素不會影響動物的正常生理功能。
(2)熒光素是280道爾頓的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。
(3) 熒光素在體內(nèi)擴散速度快，可通過腹腔注射或尾部靜脈注射進入動物體內(nèi)。腹腔注射擴散較慢，持續(xù)發(fā)光長。熒光素腹腔注射老鼠后約1min后表達熒光素酶的細胞開始發(fā)光，10min后強度達到穩(wěn)定的zui高點，在zui高點持續(xù)約20~30 min后開始衰減，約3h后熒光素排除，發(fā)光全部消失，檢測時間是在注射后15~35min之間；若進行熒光素靜脈注射，擴散快，但發(fā)光持續(xù)時間很短?？蒲腥藛T根據(jù)大量的實驗總結(jié)出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。
(4) 觀察時間的間隔沒有zui短限制，只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動物體內(nèi)有一定的代謝過程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道，可以控制對下一次觀察結(jié)果的影響。
 
3. 光學(xué)原理
    光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質(zhì)時會發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內(nèi)可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用活體動物生物發(fā)光成像技術(shù)zui少可以檢測到皮下的幾百個細胞。當(dāng)然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的zui少細胞數(shù)是不同的。一般認為，每一厘米深度，發(fā)光強度衰減10倍，血液豐富的組織或器官（比如心臟、肝臟、肺臟）衰減多，與骨骼相鄰的組織或器官衰減少。在相同的深度情況下，檢測到的發(fā)光強度和細胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系，可由儀器量化檢測到的光強度，反映出細胞的數(shù)量。