化學(xué)致癌物誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

(1)原理：化學(xué)致癌作用(chemical carcinogenesis)是指化學(xué)物質(zhì)引起或誘導(dǎo)正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并發(fā)展成腫瘤的過程。通過細(xì)胞表型的改變，反映各種理化因素的致癌性，同時(shí)，可模擬化學(xué)致癌物在體內(nèi)致癌的過程，并可對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞做直接觀察和各種分析。其中以敘利亞地鼠胚胎初代培養(yǎng)細(xì)胞較為常用，現(xiàn)在以N一甲基一N'一硝基一N一亞硝基胍(MNNG)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)為例。

(2)材料

1)動(dòng)物：鼠(如：敘利亞地鼠，金倉鼠等)。

2)細(xì)胞生長(zhǎng)液：含20％小牛血清的RPMI 1640或MEM培養(yǎng)液。

3)維持液：含5％小牛血清的RPMI 1640或MEM培養(yǎng)液。

4)消化液：O．25％*(含O．01％EDTA)。

5)凍存液：含lO％小牛血清的DMSO。

6)致癌劑：MNNG。

7)洗液：PBS。

(3)方法

1)取材：妊娠第13天鼠，取數(shù)個(gè)同窩胚胎，去頭和內(nèi)臟，在無菌條件下剪碎至米粒大小，再用0．25％*(含O．Ol％EDTA)37℃消化30min，濾過，低速離心，吸除消化液，加入營(yíng)養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，接種人75cm培養(yǎng)瓶中，接種密度為10～20×106／75 cm，37℃培養(yǎng)2～3d。

2)貯存：選大批生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞凍存。

3)致癌物處理：取凍存細(xì)胞，解凍后接種于25ml培養(yǎng)瓶中，每瓶含細(xì)胞10萬～30萬。待細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入指數(shù)增生期時(shí)，加入含0．5～1．Omg／L MNNG的*培養(yǎng)基，在37℃孵箱中培養(yǎng)12～48h。

4)低血清培養(yǎng)：棄掉MNNG致突變劑，用溫PBS洗2～3次，加入含20％小牛血清，繼續(xù)置溫箱中培養(yǎng)2～3周，然后改用含5％血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。低血清培養(yǎng)液不利于正常細(xì)胞牛長(zhǎng)，但已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞仍能增殖和形成轉(zhuǎn)化灶。

5)轉(zhuǎn)化灶的形成：用致癌物處理過的細(xì)胞于10d后在正常細(xì)胞之間，可產(chǎn)生數(shù)量不等的轉(zhuǎn)化灶。轉(zhuǎn)化灶由密集而重疊的細(xì)胞組成。在透光檢查時(shí)，肉眼可見有大小不等的白色斑塊轉(zhuǎn)化灶。顯微鏡下觀察，未轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，胞體增大，成多邊形，生長(zhǎng)無方向性，失去接觸抑制，向三維空間延伸排列，細(xì)胞相互重疊。在轉(zhuǎn)化灶邊緣，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與正常細(xì)胞界限分明，形態(tài)區(qū)別相當(dāng)明顯。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化后形態(tài)變化不如成纖維細(xì)胞差別大，需仔細(xì)識(shí)別。

6)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的分離：將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化灶用記號(hào)筆標(biāo)記。用細(xì)胞刮去除未發(fā)生轉(zhuǎn)化的外圈正常細(xì)胞。向瓶?jī)?nèi)加入PBS清洗3次，再加入消化液．37℃下消化數(shù)分鐘。鏡下觀察細(xì)胞變圓時(shí)，加人含10%小牛血清的*培養(yǎng)液，反復(fù)用吸管吹打分散，制成細(xì)胞懸液，分瓶培養(yǎng)。成單層后，再用傳代法擴(kuò)大培養(yǎng)。

(4)轉(zhuǎn)化細(xì)胞觀察與鑒定：轉(zhuǎn)化灶由密集而重疊的細(xì)胞組成。肉眼可見有大小不等的白色斑塊轉(zhuǎn)化灶。顯微鏡下觀察，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，胞體增大，成多邊形，生長(zhǎng)無方向性．失去接觸抑制，向三維空間延伸排列，細(xì)胞相互重疊。在轉(zhuǎn)化灶邊緣，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與正常細(xì)胞界限分明，形態(tài)區(qū)別明顯。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化后形態(tài)變化不如成纖維細(xì)胞差別大，需仔細(xì)識(shí)別。