組織上的蛋白表達(dá)程度，在圖片上表現(xiàn)為免疫染色的深淺及面積大小。用肉眼只能定性地進(jìn)行判讀，zui多粗略地作一個主觀的分級評價。使用圖像分析軟件則可以對圖片染色的程度作一個定量的測量。這個測量結(jié)果與切片上的蛋白表達(dá)強(qiáng)度有理論上的線性相關(guān)性。所以能客觀定量地反映它。

在圖像分析的方法中，使用灰度來表示一個點(diǎn)的明暗程度，而圖片上一個點(diǎn)的明暗程度是與切片上免疫染色物的“光學(xué)密度（OD，Optical Density ）"決定的，再往下追蹤一步，就是與組織切片上這個點(diǎn)的蛋白表達(dá)程度決定的。這有點(diǎn)類似于分光光度計的情形，比色皿里液體樣品的吸光度與液體中吸光成分的濃度相關(guān)，符合朗伯-比爾定律。圖片上一個點(diǎn)的光密度則與該點(diǎn)上的蛋白表達(dá)程度正相關(guān)（近似為正比）。所以測量一個點(diǎn)的光密度值，就是在測量這個點(diǎn)上蛋白表達(dá)程度的一個相對的量值。

朗伯-比爾定律：A = lg(1/T) = kbC

A為吸光度,T為透射比,是投射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度

c為吸光物質(zhì)的濃度 b為吸收層厚度

請注意：郎伯比爾定律中的指數(shù)關(guān)系表現(xiàn)在吸光度A與透射率T之間。吸光度A就是光密度OD。它與樣品濃度是線性關(guān)系。所以圖片上光密度值與蛋白表達(dá)之間的關(guān)系理論上也是線性的。但它與灰度值之間的關(guān)系是指數(shù)的。因此，測量光密度值能更緊密地與蛋白表達(dá)程度相關(guān)，而灰度值則類似于透光率，它與蛋白表達(dá)程度的關(guān)系是朗伯比爾定律的反向的指數(shù)關(guān)系。這就是我一再強(qiáng)調(diào)要測量光密度值的原因。

在分光光度法中，我們需要作標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量分析樣品的實際濃度，但在組織切片的情形下，是沒法作標(biāo)準(zhǔn)曲線的。所以我們只能測量到一個相對值。能對不同點(diǎn)的蛋白表達(dá)程度進(jìn)行比較，但不能測量到這個點(diǎn)的蛋白量具體是多少微克。把一片區(qū)域內(nèi)所有的點(diǎn)的光密度值累加起來，就得到一個積分光密度（IOD, Integrate Optical Density ）。 圖片上一片片的染色斑塊的深淺與范圍反映了切片上的特定蛋白表達(dá)的程度，它可以由圖片上的積分光密度來相對定量地來表示。

光密度值是一個相對的數(shù)值，所以它是沒有單位的！所以后面的積分光密度值與平均光密度值都是沒有單位的。

這種相對的測量數(shù)值對我們設(shè)計圖像分析方法有直接的影響。我們沒法通過圖像分析的方法測量出切片上有多少測定的蛋白。只能通過比較的方法來判斷實驗組樣品與對照組樣品之間的蛋白表達(dá)差異。

在圖像分析的方法中，使用灰度來表示一個點(diǎn)的明暗程度，而圖片上一個點(diǎn)的明暗程度是與切片上免疫染色物的“光學(xué)密度（OD，Optical Density ）"決定的，再往下追蹤一步，就是與組織切片上這個點(diǎn)的蛋白表達(dá)程度決定的。這有點(diǎn)類似于分光光度計的情形，比色皿里液體樣品的吸光度與液體中吸光成分的濃度相關(guān)，符合朗伯-比爾定律。圖片上一個點(diǎn)的光密度則與該點(diǎn)上的蛋白表達(dá)程度正相關(guān)（近似為正比）。所以測量一個點(diǎn)的光密度值，就是在測量這個點(diǎn)上蛋白表達(dá)程度的一個相對的量值。

朗伯-比爾定律：A = lg(1/T) = kbC

A為吸光度,T為透射比,是投射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度

c為吸光物質(zhì)的濃度 b為吸收層厚度

請注意：郎伯比爾定律中的指數(shù)關(guān)系表現(xiàn)在吸光度A與透射率T之間。吸光度A就是光密度OD。它與樣品濃度是線性關(guān)系。所以圖片上光密度值與蛋白表達(dá)之間的關(guān)系理論上也是線性的。但它與灰度值之間的關(guān)系是指數(shù)的。因此，測量光密度值能更緊密地與蛋白表達(dá)程度相關(guān)，而灰度值則類似于透光率，它與蛋白表達(dá)程度的關(guān)系是朗伯比爾定律的反向的指數(shù)關(guān)系。這就是我一再強(qiáng)調(diào)要測量光密度值的原因。

在分光光度法中，我們需要作標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量分析樣品的實際濃度，但在組織切片的情形下，是沒法作標(biāo)準(zhǔn)曲線的。所以我們只能測量到一個相對值。能對不同點(diǎn)的蛋白表達(dá)程度進(jìn)行比較，但不能測量到這個點(diǎn)的蛋白量具體是多少微克。把一片區(qū)域內(nèi)所有的點(diǎn)的光密度值累加起來，就得到一個積分光密度（IOD, Integrate Optical Density ）。 圖片上一片片的染色斑塊的深淺與范圍反映了切片上的特定蛋白表達(dá)的程度，它可以由圖片上的積分光密度來相對定量地來表示。

光密度值是一個相對的數(shù)值，所以它是沒有單位的！所以后面的積分光密度值與平均光密度值都是沒有單位的。

這種相對的測量數(shù)值對我們設(shè)計圖像分析方法有直接的影響。我們沒法通過圖像分析的方法測量出切片上有多少測定的蛋白。只能通過比較的方法來判斷實驗組樣品與對照組樣品之間的蛋白表達(dá)差異。

測量了圖片上特定區(qū)域的IOD之后，還需要測量這個區(qū)域的面積。然后計算出一個平均光密度值 （mean optical density = IOD SUM / area SUM）在整個分析過程中，一般每張圖片測量出的只是一個平均光密度值，作為一個測量數(shù)據(jù)。一張切片則需要拍攝多張照片，這些照片各自的光密度平均值平均 之后可以作為這張切片的測量數(shù)值。一個實驗樣品又可能會制作多張切片，所以zui終一個樣品（一塊組織，一個動物，一個病例等）的測量數(shù)據(jù)就是所有這些照片的 平均光密度值的平均值。在兩組實驗樣品的統(tǒng)計處理中，就是把每個實驗樣品的所有照片的平均光密度值再作一次平均，作為該樣品的測量數(shù)值。一組樣品的測量值 再計算其平均值與標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計分析。

對細(xì)胞核上蛋白的免疫組化測量有其特殊性。如果蛋白只在細(xì)胞核上表達(dá)，則不需要對核作藍(lán)染，切片上只有細(xì)胞核上有黃色染色物?？梢灾苯舆M(jìn)行分析測量。
在 更多的情況下，對細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)染是必須的。只有染上藍(lán)色才能判斷細(xì)胞核的區(qū)域。但同時，藍(lán)染對細(xì)胞核的光密度測量造成了嚴(yán)重干擾。會導(dǎo)致光密度測量值的* 誤差。這時候用肉眼主觀判斷與圖像分析測量的結(jié)果基本上沒啥區(qū)別了。一個主觀的定量方法就是用肉眼判斷陽性細(xì)胞核與陰性細(xì)胞核，然后計數(shù)其比例作為一個定 量的測量值。但這只適用于切片上有兩類細(xì)胞的情況。測量細(xì)胞核上的免疫組化圖片需要從染色開始就要考慮其分析測量過程。過程會比較復(fù)雜。這也相當(dāng)于一個實 驗方法的研究課題了。