組織上的蛋白表達(dá)程度，在圖片上表現(xiàn)為免疫染色的深淺及面積大小。用肉眼只能定性地進(jìn)行判讀，zui多粗略地作一個(gè)主觀(guān)的分級(jí)評(píng)價(jià)。使用圖像分析軟件則可以對(duì)圖片染色的程度作一個(gè)定量的測(cè)量。這個(gè)測(cè)量結(jié)果與切片上的蛋白表達(dá)強(qiáng)度有理論上的線(xiàn)性相關(guān)性。所以能客觀(guān)定量地反映它。

在圖像分析的方法中，使用灰度來(lái)表示一個(gè)點(diǎn)的明暗程度，而圖片上一個(gè)點(diǎn)的明暗程度是與切片上免疫染色物的“光學(xué)密度（OD，Optical Density ）"決定的，再往下追蹤一步，就是與組織切片上這個(gè)點(diǎn)的蛋白表達(dá)程度決定的。這有點(diǎn)類(lèi)似于分光光度計(jì)的情形，比色皿里液體樣品的吸光度與液體中吸光成分的濃度相關(guān)，符合朗伯-比爾定律。圖片上一個(gè)點(diǎn)的光密度則與該點(diǎn)上的蛋白表達(dá)程度正相關(guān)（近似為正比）。所以測(cè)量一個(gè)點(diǎn)的光密度值，就是在測(cè)量這個(gè)點(diǎn)上蛋白表達(dá)程度的一個(gè)相對(duì)的量值。

朗伯-比爾定律：A = lg(1/T) = kbC

A為吸光度,T為透射比,是投射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度

c為吸光物質(zhì)的濃度 b為吸收層厚度

請(qǐng)注意：郎伯比爾定律中的指數(shù)關(guān)系表現(xiàn)在吸光度A與透射率T之間。吸光度A就是光密度OD。它與樣品濃度是線(xiàn)性關(guān)系。所以圖片上光密度值與蛋白表達(dá)之間的關(guān)系理論上也是線(xiàn)性的。但它與灰度值之間的關(guān)系是指數(shù)的。因此，測(cè)量光密度值能更緊密地與蛋白表達(dá)程度相關(guān)，而灰度值則類(lèi)似于透光率，它與蛋白表達(dá)程度的關(guān)系是朗伯比爾定律的反向的指數(shù)關(guān)系。這就是我一再?gòu)?qiáng)調(diào)要測(cè)量光密度值的原因。

在分光光度法中，我們需要作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)定量分析樣品的實(shí)際濃度，但在組織切片的情形下，是沒(méi)法作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的。所以我們只能測(cè)量到一個(gè)相對(duì)值。能對(duì)不同點(diǎn)的蛋白表達(dá)程度進(jìn)行比較，但不能測(cè)量到這個(gè)點(diǎn)的蛋白量具體是多少微克。把一片區(qū)域內(nèi)所有的點(diǎn)的光密度值累加起來(lái)，就得到一個(gè)積分光密度（IOD, Integrate Optical Density ）。 圖片上一片片的染色斑塊的深淺與范圍反映了切片上的特定蛋白表達(dá)的程度，它可以由圖片上的積分光密度來(lái)相對(duì)定量地來(lái)表示。

光密度值是一個(gè)相對(duì)的數(shù)值，所以它是沒(méi)有單位的！所以后面的積分光密度值與平均光密度值都是沒(méi)有單位的。

這種相對(duì)的測(cè)量數(shù)值對(duì)我們?cè)O(shè)計(jì)圖像分析方法有直接的影響。我們沒(méi)法通過(guò)圖像分析的方法測(cè)量出切片上有多少測(cè)定的蛋白。只能通過(guò)比較的方法來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)組樣品與對(duì)照組樣品之間的蛋白表達(dá)差異。

在圖像分析的方法中，使用灰度來(lái)表示一個(gè)點(diǎn)的明暗程度，而圖片上一個(gè)點(diǎn)的明暗程度是與切片上免疫染色物的“光學(xué)密度（OD，Optical Density ）"決定的，再往下追蹤一步，就是與組織切片上這個(gè)點(diǎn)的蛋白表達(dá)程度決定的。這有點(diǎn)類(lèi)似于分光光度計(jì)的情形，比色皿里液體樣品的吸光度與液體中吸光成分的濃度相關(guān)，符合朗伯-比爾定律。圖片上一個(gè)點(diǎn)的光密度則與該點(diǎn)上的蛋白表達(dá)程度正相關(guān)（近似為正比）。所以測(cè)量一個(gè)點(diǎn)的光密度值，就是在測(cè)量這個(gè)點(diǎn)上蛋白表達(dá)程度的一個(gè)相對(duì)的量值。

朗伯-比爾定律：A = lg(1/T) = kbC

A為吸光度,T為透射比,是投射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度

c為吸光物質(zhì)的濃度 b為吸收層厚度

請(qǐng)注意：郎伯比爾定律中的指數(shù)關(guān)系表現(xiàn)在吸光度A與透射率T之間。吸光度A就是光密度OD。它與樣品濃度是線(xiàn)性關(guān)系。所以圖片上光密度值與蛋白表達(dá)之間的關(guān)系理論上也是線(xiàn)性的。但它與灰度值之間的關(guān)系是指數(shù)的。因此，測(cè)量光密度值能更緊密地與蛋白表達(dá)程度相關(guān)，而灰度值則類(lèi)似于透光率，它與蛋白表達(dá)程度的關(guān)系是朗伯比爾定律的反向的指數(shù)關(guān)系。這就是我一再?gòu)?qiáng)調(diào)要測(cè)量光密度值的原因。

在分光光度法中，我們需要作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)定量分析樣品的實(shí)際濃度，但在組織切片的情形下，是沒(méi)法作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的。所以我們只能測(cè)量到一個(gè)相對(duì)值。能對(duì)不同點(diǎn)的蛋白表達(dá)程度進(jìn)行比較，但不能測(cè)量到這個(gè)點(diǎn)的蛋白量具體是多少微克。把一片區(qū)域內(nèi)所有的點(diǎn)的光密度值累加起來(lái)，就得到一個(gè)積分光密度（IOD, Integrate Optical Density ）。 圖片上一片片的染色斑塊的深淺與范圍反映了切片上的特定蛋白表達(dá)的程度，它可以由圖片上的積分光密度來(lái)相對(duì)定量地來(lái)表示。

光密度值是一個(gè)相對(duì)的數(shù)值，所以它是沒(méi)有單位的！所以后面的積分光密度值與平均光密度值都是沒(méi)有單位的。

這種相對(duì)的測(cè)量數(shù)值對(duì)我們?cè)O(shè)計(jì)圖像分析方法有直接的影響。我們沒(méi)法通過(guò)圖像分析的方法測(cè)量出切片上有多少測(cè)定的蛋白。只能通過(guò)比較的方法來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)組樣品與對(duì)照組樣品之間的蛋白表達(dá)差異。

測(cè)量了圖片上特定區(qū)域的IOD之后，還需要測(cè)量這個(gè)區(qū)域的面積。然后計(jì)算出一個(gè)平均光密度值 （mean optical density = IOD SUM / area SUM）在整個(gè)分析過(guò)程中，一般每張圖片測(cè)量出的只是一個(gè)平均光密度值，作為一個(gè)測(cè)量數(shù)據(jù)。一張切片則需要拍攝多張照片，這些照片各自的光密度平均值平均 之后可以作為這張切片的測(cè)量數(shù)值。一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品又可能會(huì)制作多張切片，所以zui終一個(gè)樣品（一塊組織，一個(gè)動(dòng)物，一個(gè)病例等）的測(cè)量數(shù)據(jù)就是所有這些照片的 平均光密度值的平均值。在兩組實(shí)驗(yàn)樣品的統(tǒng)計(jì)處理中，就是把每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的所有照片的平均光密度值再作一次平均，作為該樣品的測(cè)量數(shù)值。一組樣品的測(cè)量值 再計(jì)算其平均值與標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

對(duì)細(xì)胞核上蛋白的免疫組化測(cè)量有其特殊性。如果蛋白只在細(xì)胞核上表達(dá)，則不需要對(duì)核作藍(lán)染，切片上只有細(xì)胞核上有黃色染色物。可以直接進(jìn)行分析測(cè)量。
在 更多的情況下，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)染是必須的。只有染上藍(lán)色才能判斷細(xì)胞核的區(qū)域。但同時(shí)，藍(lán)染對(duì)細(xì)胞核的光密度測(cè)量造成了嚴(yán)重干擾。會(huì)導(dǎo)致光密度測(cè)量值的* 誤差。這時(shí)候用肉眼主觀(guān)判斷與圖像分析測(cè)量的結(jié)果基本上沒(méi)啥區(qū)別了。一個(gè)主觀(guān)的定量方法就是用肉眼判斷陽(yáng)性細(xì)胞核與陰性細(xì)胞核，然后計(jì)數(shù)其比例作為一個(gè)定 量的測(cè)量值。但這只適用于切片上有兩類(lèi)細(xì)胞的情況。測(cè)量細(xì)胞核上的免疫組化圖片需要從染色開(kāi)始就要考慮其分析測(cè)量過(guò)程。過(guò)程會(huì)比較復(fù)雜。這也相當(dāng)于一個(gè)實(shí) 驗(yàn)方法的研究課題了。