谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）測試盒的測定原理

（微板法）

一、測定原理：

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）在 37℃及 PH7.4 條件下，作用于丙

氨酸及α-酮戊二酸組成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。反應(yīng)

30min 后（固定時間）加入 2,4-二硝基苯肼（DNPH）鹽酸溶

液，既中止反應(yīng)，同時 DNPH 與酮酸中羰基加成，生成丙酮

酸苯腙。苯腙在堿性條件下呈紅棕色，于 505nm 比讀吸光度

并計算酶活力。

二、試劑的組成與配制：(96T)

試劑一:谷丙轉(zhuǎn)氨酶基質(zhì)液,5mL×1 瓶，4℃冰箱保存 6 個月；

試劑二:2,4—二硝基苯肼液,5mL×1 瓶，4℃冰箱保存 6 個月；

試劑三:4mol/L 氫氧化鈉液,5mL×1 瓶，室溫密封保存 6 個月；

0.4mol/L 氫氧化鈉液的配制,臨用時按 4mol/L 氫氧化鈉液:雙

蒸水=1∶9 的比例稀釋，需多少配多少，室溫密封保存。

試劑四:2mmol/mL 丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液×1 支，4℃冰箱保存 6 個月；

試劑五:0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液×1 支，4℃冰箱保存 6 個月。

三、操作過程：

1、樣本前處理:

①、血清（漿）及其它液體樣本待測：直接測定。

②、動物組織樣本：準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量（g）：體積

(mL)=1:9 的比例，加入 9 倍體積的生理鹽水，冰水浴條件

下機械勻漿，2500 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，取上清液待測。

③、培養(yǎng)細(xì)胞樣本前處理：將收集好的細(xì)胞用等滲緩沖液（推

薦 0.1mol/L pH7～7.4 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水）清洗 1～

2 次；1000 轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘,棄上清,留細(xì)胞沉淀，加入勻

漿介質(zhì)（推薦加入 0.1mol/L pH7～7.4 磷酸鹽緩沖液或生

理鹽水），冰水浴條件下超聲破碎或手動勻漿，制備好的

勻漿液不離心，待測。

2、操作表:

1、比色法中常用的有賴氏（Reitman-Frankel）法及金氏（King）

法。賴氏法標(biāo)準(zhǔn)曲線所定單位數(shù)，是用實驗方法和卡門氏分

光

光度法（速率法）作對比測定求得的。以卡門氏單位報

告結(jié)果，比較準(zhǔn)確。

卡門氏單位定義：1mL 液體，反應(yīng)液總?cè)萘?/span> 3mL，波長 340nm，

1cm 光徑，25℃，1min 內(nèi)所生成的丙酮酸，使 NADH 氧化

成 NAD+而引起吸光度每下降 0.001 為一個單位（1 卡門氏

單位=0.482 U/L，25℃）。

2、一般血清標(biāo)本內(nèi)源性酮酸很少，血清對照孔吸光度值接近試

劑空白孔（以雙蒸水代替血清，其他和對照孔同樣操作）。

所以，成批標(biāo)本測定時，一般不需要每一標(biāo)本都作本身血清

對照孔，以試劑空白孔代替即可，但對脂血、黃疸或溶血血

清，每份標(biāo)本應(yīng)作對照孔。

3、酶活力超過 150 卡門氏單位時，用生理鹽水稀釋血清后重測。

4、應(yīng)將一般血清的對照孔（或稱標(biāo)本空白孔）的吸光度作為日

常質(zhì)控的指標(biāo)之一；如相差大，可考慮α-酮戊二酸濃度、DNPH

濃度及儀器等原因引起。

5、血清中 ALT 在室溫（25℃）可保存 2 天，在 0～4℃可保存一

周，在-25℃可保存 1 個月。

附錄Ⅰ：ALT 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1、操作表:

附錄Ⅱ：組織中 ALT 測定

1、樣本前處理：

準(zhǔn)確稱取組織重量,按重量(g):體積(mL)=1:9 的比例,加入 9 倍體

積的生理鹽水,冰水浴條件下機械勻漿,制成 10%的組織勻漿,2500

轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,取上清液,再用生理鹽水稀釋到適宜濃度(通過標(biāo)

準(zhǔn)曲線后計算得勻漿液卡門氏單位值小于 150)待測。(取部分上清

液測蛋白濃度,蛋白定量試劑盒本所有售)

2、操作表：

組織中 活力= 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得 ?待測勻漿液蛋白

勻漿液ALT活力 濃度

附錄Ⅲ：血清（漿）中 ALT 測定

1、前處理：

血清(漿)直接取樣進(jìn)行測定。（若酶活力超過 150 卡門氏單位

時，需用生理鹽水稀釋血清后重新測定）

2、操作表：

 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）測試盒的測定原理