AgNO3 Staining NOR and Salite Association of Acrocentric Chromosome

【實驗目的】
熟悉銀染的原理和方法。

【實驗原理】
人類近端著絲粒染色體的副縊痕與核仁形成有關，故稱為核仁形成區(qū)（NOR）。當位于此處的18S、28S核糖體RNA的基因（rDNA）具有轉(zhuǎn)錄活性時，應用銀染技術可使NOR特異性著色（褐黑色）。進一步證明銀染物質(zhì)不是rDNA，亦不是rRNA，可能是核仁形成區(qū)特異的蛋白質(zhì)，即和rRNA轉(zhuǎn)錄相的酸性蛋白。人類核糖體RNA基因位于5對近端著絲點染色體短臂的次猛痕處，即人類的核仁形成區(qū)。在正常人中， 不是所有核仁形成區(qū)均被銀染，其范圍大約4-10。應用銀染法可以覺察正常人體核糖體RNA基因的活動。此外，人類近端著絲粒染色體的隨體間易發(fā)生聯(lián)合，應用銀染技術可在發(fā)生聯(lián)合的染色體間清楚地看到銀染物質(zhì)相連。因此，應用銀染核仁形成區(qū)（Ag-NOR）與近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合（Ag-AA）技術，可以分析有活性的rRNA基因的動態(tài)變化。正常人Ag-NOR平均為5.8/細胞。

【實驗用品】
1. 恒溫水浴箱、顯微鏡、平皿、牙簽、擦鏡紙、鑷子；
2. 預制染色體玻片標本、0.1％甲酸、AgNO3（50％）。1：20 Giemsa,5mol/L HCl。

【實驗步驟】
1. 按半微量法采取外周靜脈血，接種培養(yǎng)。常規(guī)法制片。將染色體玻片標本在室溫下放置2～3天。
2. 將標本置入5mol/L HCl溶液中常溫處理5分鐘，蒸餾水沖洗2-3次，甩干。
3． 將500mg AgNO3溶于1 ml 0.1％甲酸溶液中，混勻后立即滴4～5（5ml）滴至玻片標本上。
4. 在平皿中平行放置兩根牙簽，將玻片標本放在牙簽上。
5. 在標本上蓋一張比玻片稍小的擦鏡紙，用鑷子掀動紙片數(shù)次，使染液均勻分散在標本上。
6. 將平皿置于60℃水浴箱中處理3-5分鐘，直至擦鏡紙呈棕黃色終止反應。
7. 蒸餾水沖洗去擦鏡紙，以1：20 Giemsa染液復染3分鐘。水洗，氣干。
8. 鏡下觀察。

【實驗結(jié)果與分析】
1. Ag-NOR的計數(shù)：選擇銀染著色清晰的分裂相，計數(shù)6個D組（13、14、和15號染色體）和4個G組（21和22號染色體）近端著絲粒染色體，不論單側(cè)或雙側(cè)的銀染點都計數(shù)為一個有銀染的染色體。
2. Ag-AA計數(shù)：凡近端著絲粒染色體之間有銀染物質(zhì)相連的，均計數(shù)為Ag-AA。涉及2條近端著絲粒染色體的聯(lián)合，記為1個Ag-AA；涉及3條近端著絲粒染色體的聯(lián)合，如未形成閉環(huán)的，記為2個Ag-AA；3條染色體聯(lián)合形成閉環(huán)時，記為3個Ag-AA；依此類推。

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