Percoll分離液的配置與使用方法

Percoll分離液是一種經(jīng)過(guò)聚乙烯吡咯烷酮處理過(guò)的硅膠顆粒，經(jīng)過(guò)高速離心后可形成連續(xù)密度梯度，由于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。Percoll分離液采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力(200～1000g)于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果。此外，Percoll分離液不穿透生物膜，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，因此廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。Percoll常用于分離和傳話植物原生質(zhì)體、核、葉綠體、和線粒體。

適合分離細(xì)胞，亞細(xì)胞成分和大病毒(>70S)，滲透壓均勻，粘度低，可調(diào)至生理離子強(qiáng)度和pH，分離條件溫和，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，可以滅菌消毒。

Percoll分離液的配置與使用

1、不同濃度(密度)Percoll分離液的制備: 先用9份Percoll分離液與1份8.5％ NaCl混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液(0.85％ NaCl)稀釋到所需濃度。

2、不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤(rùn)，除去多余血清，這種預(yù)處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過(guò)程中一般用長(zhǎng)針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時(shí)相鄰兩層Percoll比重相差不大時(shí)，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。

3、裝樣：樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異，一般加樣體積不宜過(guò)大，細(xì)胞濃度也不可過(guò)高，否則會(huì)影響細(xì)胞的分離和回收。

4、離心：一般采用離心力為400g，時(shí)間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機(jī)加速、降速時(shí)要慢，要平穩(wěn)。

5、取樣：當(dāng)所要分離的細(xì)胞絕大部分在兩層的界面時(shí)，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞;有時(shí)大部分細(xì)胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細(xì)胞經(jīng)2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測(cè)用。

Percoll細(xì)胞分離液的優(yōu)點(diǎn)

Percoll滲透性低、不穿透細(xì)胞、密度高、無(wú)毒害，是目前較理想的介質(zhì)。Percoll密度梯度離心已被多次成功地用于動(dòng)物細(xì)胞及其細(xì)胞器的分離，純化了包括人血液細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、紅血球細(xì)胞、白血球細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞等在內(nèi)的十余種動(dòng)物細(xì)胞。

Percoll細(xì)胞分離液注意事項(xiàng)：

1、Percoll細(xì)胞分離液在儲(chǔ)存及孵育過(guò)程中避免將實(shí)際保留在強(qiáng)光中。

2、試劑瓶蓋需蓋緊，防止蒸發(fā)和污染。

Percoll分離液的配置與使用方法