適用
適用于檢測水樣中有機磷酸鹽和有機磷酸酯（硫代磷酸鹽[酯] 殺蟲劑、氨基甲酸酯(類) 殺蟲劑）。檢測其它樣品時需要我公司取得相關(guān)前處理的資料。
原理
這是一個定性的有機磷酸鹽和有機磷酸酯的檢測方法。對乙酰*酯酶的抑制劑進行了修飾。乙酰*酯酶（ACh-E）水解acetylthiocholine (ATC)，然而ATC可以與5,5’-Dithio-bis(2-Nitrobenzoic Acid) [DTNB]反應(yīng)
生成黃色可以在405 nm下讀取吸光度值。如果樣品中還有有機磷酸鹽和有機磷酸酯，那么它們將抑制ACh-E的活性，影響顏色反應(yīng)的發(fā)生。有機磷酸鹽和有機磷酸酯檢測限與他們對酶活性的抑制能力有關(guān)。
如果能證實樣品中僅含有機磷酸鹽和有機磷酸酯，這個測定和合適的標準聯(lián)用可以進行定量檢測。
試劑盒組成
1 | 1塊酶標板 8條 X 12孔 |
2 | 1瓶l (藍蓋t), 用于稀釋 thesubstate (ATC), 5 ml. |
3 | 1 瓶 (綠蓋), 用于稀釋 lyophilized ACh-E, 3 ml. |
4 | 1 黃色瓶 1 ml 陽性殺蟲劑對照 5 ppb Diazinon（二嗪農(nóng),地亞農(nóng),敵匹硫磷） 溶解于50% MEOH |
5 | 1 黃色瓶 (橙黃色熒光蓋), 1 ml of OXIDIZER（氧化劑） . |
6 | 檢測緩沖液和氧化劑稀釋液(橙黃色熒光蓋), 10 ml. |
7 | 1 瓶 (紅蓋), 3 ml.-NEUTRALIZER（中和劑） |
8 | 1 瓶 (綠蓋) ACh-E, lyophilized（低壓凍干） |
9 | 1 瓶 (綠蓋), SUBSTRATE（酶作用底物）, ATC, lyophilized（低壓凍干） |
10 | 1 瓶 (黃色熒光蓋), CHROMOGEN(DTNB) 色原體3 ml. |
11 | 1 瓶 (紫蓋),STOPPING SOLUTION（終止液）, 3 ml. |
12 | 1黃色瓶 1ml 陰性殺蟲劑對照溶解于50% MEOH. |
保存和穩(wěn)定性
儲存在 2-8°C. 在有效期內(nèi)都可以使用。試劑盒用完后的垃圾要按照當?shù)卣恼叻ㄒ?guī)處理。
需要但不提供的試劑
25-1000 ul 的移液器和吸頭
405-450 nm 酶標儀
用于氧化劑稀釋的試管和管形瓶
樣品信息
1.水樣：
- 把水樣溶于等體積 MEOH中（例如：1ml水樣+ 1mlMEOH）。除水樣外請我公司索取前處理方法。
- 來自廢水表面的不溶殘留物或濃縮后的干物質(zhì)也可以處理。
- 包含粗物質(zhì)的水樣需要過濾(e.g. 0.2 um Anotop™ 25 Plus, Whatman, Inc.)。色素物質(zhì)或涂料對檢測結(jié)果有影響，因此要用類似的物質(zhì)做一個陰性對照。
2.蔬菜/水果：
- 稱量10克攪碎樣品于一個50mL的離心管里，加入20mL分析純甲醇，渦旋混勻1min，室溫（22.5±2.5）°C下轉(zhuǎn)速4000rpm離心3min;
- 過濾轉(zhuǎn)移一定體積上清液到干凈燒杯里，取1mL過濾液于一試管里，加入1mL蒸餾水稀釋；
- 渦旋混勻1min，可得待檢樣品液；
注：（若樣品OD/陰性質(zhì)控OD x* ＞ 20%為陰性，MRL為10ppb）
3.酒樣：
- 取5mL酒樣于一離心管內(nèi)，加入0.2gNaCl,2mL正己烷，進行渦旋振蕩3min進行萃取，靜置5min，轉(zhuǎn)移上層液至另一裝有0.4g無水NaSO4的離心管里，再重復(fù)一遍以上萃取步驟，合并全部有機相。
- 4000rpm轉(zhuǎn)速離心5min，轉(zhuǎn)移上層正己烷至干凈的試管中氮吹吹干，用1mL50%甲醇復(fù)溶干燥物，
- 復(fù)溶液過0.2um有機相濾膜，可得待檢樣品液；
注：（若樣品OD/陰性質(zhì)控OD x* ＞ 20%為陰性，MRL為0.5ppb）
試劑準備
在使用試劑盒時所有試劑都要回復(fù)到室溫。
1）ACh-E –加3ml ACh-E diluent（稀釋液）到凍干的 ACh-E 中，蓋緊蓋適當?shù)恼鹗?，在檢測前至少要溶解5min。
2）Oxidizer（氧化劑）–根據(jù)所測樣品的數(shù)量配制氧化劑。稀釋氧化劑（1份氧化劑+ 9份氧化劑稀釋液）。適當?shù)恼鹗?，每次檢測前配制必須是新鮮的。
3）Substrate (ATC) （酶作用底物）– 加3ml ATC 稀釋液到凍干的ATC 中，蓋緊蓋適當?shù)恼鹗帯?/span>
注意事項
操作要規(guī)范，在加完每種試劑后要混合均勻。注意在震蕩時不要把微孔中的液體溢出去（震蕩時可以用手拿著微孔板在桌面上做圓周運動。在加液時避免吸頭和反應(yīng)液直接接觸要把液體直接加到微孔板的底部。
確保每個微孔中加的液體的量一致。避免試劑的交叉污染和攜帶污染，添加每個樣品都要用干凈的吸頭。加液時吸頭不要和微孔壁上的液體接觸。如果在戶外操作要避免陽光直射。不要使用過期試劑。避免皮膚和粘膜與試劑接觸。如果試劑與皮膚接觸請用大量的水沖洗。
局限性
這個Abraxis OP/Carbamate 檢測方法對不同的有機磷酸鹽和氨基甲酸酯(類)的檢測特異性不同。請參考后面的特異性表。如果需要可以通過其它傳統(tǒng)的方法如GC, HPLC,驗證。
對照
陽性對照：濃度為5 ppb Diazinon（二嗪農(nóng),地亞農(nóng),敵匹硫磷）。在每次檢測時都要做。
檢測步驟
在做檢測之前要認真閱讀試劑配制方法和注意事項
- 在檢測用的酶標板中加入50ul檢測緩沖液（橙黃色熒光蓋）。
- 在的檢測孔中加入25ul 適當?shù)膶φ栈驑悠?。震蕩酶標?5秒
3、在每個微孔中加入25ul 稀釋的氧化劑（diluted Oxidizer），震蕩酶標板15秒，室溫孵育5min。
4、在每個微孔中加入25ul Neutralize 中和劑（紅蓋），震蕩酶標板15秒。
5、在每個微孔中加入25ul ACh-E（綠蓋），震蕩酶標板15秒，室溫孵育15min。
6、在每個微孔中加入25ul Substrate-ATC（藍蓋），震蕩酶標板15秒。
7、在每個微孔中加入25ul Chromogen – DTNB（黃色熒光蓋），震蕩酶標板15秒，室溫孵育15min。
8、在每個微孔中加入25ul終止液，震蕩酶標板15秒，在405nm 或450nm下讀數(shù)，要確保微孔中沒有氣泡。
結(jié)果分析
陰性對照和沒有檢測到有機磷酸鹽和氨基甲酸酯的樣品將呈現(xiàn)深黃色。含有有機磷酸鹽和氨基甲酸酯的樣品與陰性對照相比將呈現(xiàn)比較淺的顏色。20%的顏色抑制作用指示了有機磷酸鹽和氨基甲酸酯的檢測限或高于檢測限。
注意：如果陰性對照不能產(chǎn)生黃色說明這次檢測無效需要重新檢測。
敏感性
精密度
