實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠精原分離自睪丸組織；睪丸呈微扁的卵圓形，表面光滑，覆蓋著鞘膜臟層；深部是質(zhì)地堅(jiān)韌的白膜，在睪丸后緣增厚并進(jìn)入睪丸，形成睪丸縱膈，縱膈發(fā)出許多睪丸小隔深入睪丸實(shí)質(zhì)，將實(shí)質(zhì)分為睪丸小葉，數(shù)量約為100～200。每個(gè)小葉內(nèi)約有2～4條生精小管，具有產(chǎn)生精子的作用；生精小管之間的結(jié)締組織中有睪丸間質(zhì)細(xì)胞，具有產(chǎn)生雄激素的作用。生精小管首先匯合成為精直小管(也稱直精小管)，精直小管進(jìn)入睪丸縱膈形成睪丸網(wǎng)，之后睪丸網(wǎng)發(fā)出12～15條輸出小管通過(guò)睪丸后上緣進(jìn)入附睪。生精小管的生精上皮是精子產(chǎn)生的地方，由生精細(xì)胞和支持細(xì)胞構(gòu)成，成人的生精小管有30～70cm長(zhǎng)。精子的產(chǎn)生過(guò)程包括生精細(xì)胞的分化、支持細(xì)胞的作用、雄激素的調(diào)節(jié)等。生精細(xì)胞并不是一種細(xì)胞，它是多種細(xì)胞的統(tǒng)稱，包括精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、精子。前者依次發(fā)育分化為后者，且依次從生精上皮的基部到管腔面排列，終形成精子進(jìn)入到管腔之中，并借助生精上皮外側(cè)的肌樣細(xì)胞的收縮作用向下一級(jí)管腔移動(dòng)。精原細(xì)胞是指由睪丸精子管上皮的原始生殖細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次有絲分裂而形成的細(xì)胞。原始的胚細(xì)胞經(jīng)分化形成精原細(xì)胞，精原細(xì)胞經(jīng)復(fù)制形成初級(jí)精母細(xì)胞，初級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)次分裂后形成次級(jí)精母細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)減數(shù)次分裂形成精細(xì)胞。精細(xì)胞經(jīng)過(guò)變形終形成精子。精原細(xì)胞屬于雄性生殖細(xì)胞的早期發(fā)育階段，能不斷地進(jìn)行有絲分裂，增加細(xì)胞數(shù)量，并分化為精母細(xì)胞。精原細(xì)胞貼近基膜，細(xì)胞呈圓形，核大而圓，梁色深。精原細(xì)胞在男性的一生中具有幾乎無(wú)限分裂的能力，而且分裂過(guò)程中能夠保持原有的基因性狀不變。在增殖過(guò)程中，通過(guò)精原細(xì)胞的分裂和分化，由精原細(xì)胞產(chǎn)生精母細(xì)胞，進(jìn)入成熟分裂，因而通過(guò)增殖可大大增加精母細(xì)胞的數(shù)量。按理論推算，一個(gè)精原細(xì)胞通過(guò)數(shù)次細(xì)胞分裂，可形成上百個(gè)初級(jí)精母細(xì)胞。但在生精過(guò)程早期，生精細(xì)胞很易發(fā)生變性，故實(shí)際上少于這個(gè)數(shù)字。在精原細(xì)胞的增殖過(guò)程中，有一部分Ad型精原細(xì)胞不再繼續(xù)分裂，而是保留下來(lái)，成為新的精原干細(xì)胞，因此通過(guò)增殖不僅能使精原干細(xì)胞不斷得到更新，且能使精原干細(xì)胞保持一定數(shù)量，從而使精子的產(chǎn)生持續(xù)地進(jìn)行下去，不會(huì)枯竭。

方法簡(jiǎn)介：

實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠精原采用混合酶多步消化法制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠精原經(jīng)AP(堿性磷酸酶)免疫組化染色鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS、生長(zhǎng)添加劑、GDNF、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：圓形、橢圓形

傳代特性：可傳2-3代左右

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

大鼠精原體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長(zhǎng)培養(yǎng)基及正確的操作方法來(lái)培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項(xiàng)：

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說(shuō)明書(shū)，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問(wèn)題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請(qǐng)客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑?，個(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問(wèn)題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm皿。不是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)10cm皿。

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