(一)原理

    混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(mixed lymphocyte culture，MLC)或稱混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR)，包括雙向和單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)兩種。兩個無關(guān)個體功能止常的淋巴細(xì)胞在體外混合培養(yǎng)時，由于HLAⅡ類抗原中D和DP抗原(淋巴細(xì)胞鑒定的抗原，SD抗原)不同，可相互刺激對方的T細(xì)胞發(fā)生增殖，此為雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(雙向MLC)；若將其中一方的淋巴細(xì)胞先用C(myrtomycine C)處理或射線照射使細(xì)胞中DNA失去復(fù)制能力，但仍能刺激另一方淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化．稱為單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(單向MLC)。MLR可通過3 H—TdR摻入率、形態(tài)學(xué)檢查法及MTT法檢查反應(yīng)細(xì)胞的增殖能力。MLR主要用于移植前組織配型，也是免疫調(diào)節(jié)研究中的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１竟?jié)介紹單向MLC二方法。

(二)材料

．供者和受者淋巴細(xì)胞懸液，濃度為l×06／ml。

2．C、3 H—TdR。

3．20％NCS RPMI 640培養(yǎng)基。

(三)方法

．刺激細(xì)胞的準(zhǔn)備 在淋巴細(xì)胞懸液內(nèi)加入C，zui終濃度為25μg／ml，于37℃水浴中作用30min，000r／min離心0min，棄上清液，沉淀細(xì)胞用Hank’s液洗滌3次。

2．反應(yīng)細(xì)胞的準(zhǔn)備將分離純化的淋巴細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為×06／ml。

3．取刺激細(xì)胞和反應(yīng)細(xì)胞各O．2ml，加入．8 ml  20％NCS RPMI 640培養(yǎng)基，置37℃、5％C02孵育6d。

(四)結(jié)果分析

．形態(tài)學(xué)方法以轉(zhuǎn)化細(xì)胞百分率判斷淋巴細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度，一般認(rèn)為轉(zhuǎn)化率小于5％為陰性。

2．3 H—TdR摻入法終止培養(yǎng)前20h加入74kBq 3 H—TdR。終止培養(yǎng)后，按照前述增殖實(shí)驗(yàn)3 H—TdR摻入法收集細(xì)胞測定cpm值，并計(jì)算SI。

3．MTT法終止培養(yǎng)前6h加入MTT。培養(yǎng)終止后加酸化異丙醇O．ml，充分混勻，靜置數(shù)分鐘，按MTT比色法測OD值，并計(jì)算SI。

(五)注意事項(xiàng)

．增殖反應(yīng)的細(xì)胞應(yīng)保持高活性，一般應(yīng)大于或等于95％。此外，增殖細(xì)胞的濃度過高或過低均不利于細(xì)胞生長。

2．絲裂原刺激淋巴細(xì)胞增殖時，常需要一定數(shù)量的抗原遞呈細(xì)胞同時存在，否則難以測出細(xì)胞的增殖反應(yīng)。

3．注意無菌操作。