、 牡蠣皰疹病毒感染熒光PCR檢測試劑盒簡介
貨號：HB-909
為了適應(yīng)牡蠣皰疹病毒（OsHV）微變株的快速檢測和疫病研究的需要，本公司參照OIE發(fā)布的
水生動物疾病診斷手冊2.4.09章中的熒光PCR引物和探針序列和檢測方法。經(jīng)多次實驗及系統(tǒng)優(yōu)
化，開發(fā)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進行核酸提前和PCR檢測具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確 、
安全、操作簡單、應(yīng)用廣泛等特點及優(yōu)點。
2、 試劑盒組成
試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴增試劑，具體組成參見表 ：
表 ：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積
核酸提取試劑： 樣品 DNA 提取液
樣品 DNA 提取液 2
5ml× 管
500µl× 管
核酸擴增試劑： DEPC 水
OsHV 熒光 PCR 反應(yīng)液
Taq 酶(5U/ul)
陰性對照
OsHV 熒光陽性對照
5ml× 管
750µl× 管
40µl× 管
ml× 管
ml× 管
*保存條件：樣品 DNA 提取液 、2 和試劑盒須在-20℃保存。
3、 樣本采集，存放及運輸
3. 樣本采集
采集活的或瀕死的軟體動物，幼體（00-200mg），仔體（00-200mg）或2-3 mm2
外套膜的切片，
保存在95%的乙醇中或者–80℃保存。
3.2 存放
研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；-70 ℃以下可保存，但應(yīng)避免反復(fù)
凍融（zui多凍融 3 次）。
3.3 運輸
采用泡沫箱加冰密封進行運輸。
4、 檢測步驟
4. DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進行)：
4.. 取 n 個 .5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對照之和，對每個管進行
編號標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)
4..2 每管加入 00 µl DNA 提取液 ，然后分別加入待測樣本和陰性對照各 00µl，一份樣本換用
一個吸頭；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，2 000 r/min 離心 0 min。
4..3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入 0µl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃
條件下，2 000 r/min 離心 0 s。
4..4 00℃ 干浴或沸水浴 0 min；加入 90µl DEPC 水，2 000 r/min 離心 0 min，吸取上清，即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）。
4.2 熒光 PCR 檢測
4.2. 牡蠣皰疹病毒感染熒光PCR檢測試劑盒擴增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行）：
從試劑盒中取出熒光 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘。每個樣品測試反應(yīng)體系配制見
下表 2。
表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表
試劑 熒光 PCR 反應(yīng)液 Taq 酶 合計
用量 4.5 μL 0.5μL 5μL
4.2.2 加樣（樣本處理區(qū)進行）：
向每個PCR管中各分裝5μL的混合液，再分別加入樣本DNA模板0μL，蓋緊管蓋，500 r/min
離心 30 s。
4.2.3 熒光 PCR 檢測（在檢測區(qū)進行）：
循環(huán)條件設(shè)置：
*階段，94o
C/3 min；
第二階段，92o
C/5 s，55o
C/5s，60 o
C/30 s； 40個循環(huán)；在每次循環(huán)的60 o
C退火延伸時收集
熒光。
試驗檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。
5、 結(jié)果判定
5. 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣
品擴增曲線的zui高點為準(zhǔn)。
5.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
5.2.陰性對照無Ct值或無擴增曲線。
5.2.2陽性對照的Ct值應(yīng)<28.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。否則，此次實驗視為無效。
5.3 結(jié)果描述及判定
5.3.陰性
無Ct值或無擴增曲線，示樣品中無OsHV核酸。
5.3.2陽性
Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，示樣品中存在OsHV核酸。
5.4 有效原則
Ct>30的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性。
6、 相關(guān)技術(shù)信息
6. 牡蠣皰疹病毒感染熒光PCR檢測試劑盒引物序列
OsHV F：5-’ GTCGCATCTTTGGATTTAACAA -3’
OsHV R：5-’ ACTGGGATCCGACTGACAAC - 3’
Probe：5’-FAM- TGCCCCTGTCATCTTGAGGTATAGACAATC -TAMRA-3’
