小鼠活性氧簇（ROS）ELISA試劑盒檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被活性氧簇（ROS）抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的活性氧簇（ROS）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞
刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心0分鐘將血清和紅細胞迅速小心地
分離。
2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3.細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心0分鐘去除顆粒和聚合物。
4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心0分鐘
取上清。
5.保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于
-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
.酶標(biāo)儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-0uL、2-20uL、20-200uL、200-000uL
3.37℃恒溫箱
操作注意事項
.試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解
后再使用。
2.實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
3.濃度為0的S0號標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍，zui終結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。
4.嚴格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
5.所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱96孔配置48孔配置備注
微孔酶標(biāo)板2孔×8條2孔×4條無
標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL*6管0.3mL*6管無
樣本稀釋液6mL3mL無
檢測抗體-HRP0mL5mL無
20×洗滌緩沖液25mL5mL按說明書進行稀釋
底物A6mL3mL無
底物B6mL3mL無
終止液6mL3mL無
封板膜2張2張無
說明書份份無
自封袋個個無
注：標(biāo)準(zhǔn)品（S0-S5）濃度依次為：0、30、60、20、240、480U/ml
小鼠活性氧簇（ROS）ELISA試劑盒試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按：20稀釋，即份的20×洗滌緩
沖液加9份的蒸餾水。
洗板方法
.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置min后甩盡
孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
2.自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡min，洗板5次。
操作步驟
.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封
袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔先加待測樣本0μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不
加。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶
（HRP）標(biāo)記的檢測抗體00μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴
鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置min，甩去
洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育5min。7.每孔加入終止液50μL，5min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的
OD值。
結(jié)果判斷
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)
OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣
本濃度值。
試劑盒性能
.準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于
0.9900。
2.靈敏度：zui低檢測濃度小于.0U/ml。
3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4.重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于5%。
5.貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
6.小鼠活性氧簇（ROS）ELISA試劑盒有效期：6個月
