人多環(huán)芳烴-DNA加合物（PAHs-DNA）ELISA試劑盒檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被多環(huán)芳烴-DNA加合物（PAHs-DNA）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的多環(huán)芳烴-DNA加合物（PAHs-DNA）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞
刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心0 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地
分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心0 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心0 分鐘
取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于
-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
. 酶標儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-0uL、2-20uL、20-200uL、200-000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項
. 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20 分鐘。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解
后再使用。2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
3. 濃度為0 的S0 號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說明
書操作時樣本已經(jīng)稀釋5 倍，zui終結(jié)果乘以5 才是樣本實際濃度。
4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱96孔配置48孔配置備注
微孔酶標板2 孔×8 條2 孔×4 條無
標準品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無
樣本稀釋液6mL 3mL 無
檢測抗體-HRP 0mL 5mL 無
20×洗滌緩沖液25mL 5mL 按說明書進行稀釋
底物A 6mL 3mL 無
底物B 6mL 3mL 無
終止液6mL 3mL 無
封板膜2 張2 張無
說明書 份 份無
自封袋 個 個無
注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、50、00、200、400、800 pg/mL
試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按：20 稀釋，即 份的20×洗滌緩
沖液加9 份的蒸餾水。
洗板方法
. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置min 后甩盡
孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5 次。
2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡min，洗板5 次。
人多環(huán)芳烴-DNA加合物（PAHs-DNA）ELISA試劑盒操作步驟
. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封
袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3. 樣本孔先加待測樣本0μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不
加。
4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶
（HRP）標記的檢測抗體00μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴
鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5 次（也可用洗板機洗板）。
6. 每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育5min。
7. 每孔加入終止液50μL，5min 內(nèi)，在450nm 波長處測定各孔的
OD 值。
結(jié)果判斷
繪制標準曲線：在Excel 工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)
OD 值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣
本濃度值。
試劑盒性能
. 準確性：標準品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值，大于等于
0.9900。
2. 靈敏度：zui低檢測濃度小于.0 pg/mL。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于5%。
5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
6. 人多環(huán)芳烴-DNA加合物（PAHs-DNA）ELISA試劑盒有效期：6 個月