曲霉PCR定量試劑盒說明書
產(chǎn)品名稱：黃曲霉PCR定量試劑盒
產(chǎn)品規(guī)格：50次
運輸：低溫
保存：負20度
有效期：一年
貨期：現(xiàn)貨
黃曲霉探針法熒光定量 PCR 試劑盒黃曲霉(Aspergillusflavus.)，半知菌類，一種常見腐生真菌。多見于發(fā)霉 的糧食、糧制品及其它霉腐的有機物上。993 年黃曲mei毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO)的研究機構劃定為 類致癌物，是一種毒性*的劇毒物質。黃曲mei毒素的危害性在于對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時，可導致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黃曲mei毒素b 為多見。其毒性和致癌性也強。因此快速檢測黃曲霉具有重要意義。本產(chǎn)品是以探針法熒光定量PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測黃曲霉的試劑盒，曲霉PCR定量試劑盒它具有下列特點：
. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)黃曲霉高度保守區(qū)設計，不會跟其他微生物的DNA 發(fā)生交叉反應。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。PCR實驗方法步驟：
方法
：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
0×PCR buffer
5 μl dNTP mix（2mM）
4 μl 引物（0pM）
2 μl 引物2（0pM）
2 μl Taq酶（2U/μl）
μl DNA模板（50ng-μg/μl）
μl 加ddH2O至50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃40s → 58℃30s → 72℃60s，循環(huán)30-35次，在72℃保7min。
3：結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用00μl氯fang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-0μl電泳檢測。
產(chǎn)品僅用于科研4℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心0 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心0 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心0 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
曲霉PCR定量試劑盒需要自備的器材：
．產(chǎn)品僅用于科研儀器：分析天平、離心機、熒光 PCR 擴增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、20
µL、200 µL、000 µL）。
2．耗材：熒光 PCR 反應管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水
處理的滅菌離心管、吸頭（0 µL、200 µL、000 µL）、滅菌雙蒸水。
特點：
.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板，操作簡單，定量準確快速。
2. 引物經(jīng)過優(yōu)化，特異性強。預期的 PCR 產(chǎn)物長度為 560 bp。
3. PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳。
4. 提供陽性對照，便于分析試驗結果。操作流程：
.整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。
2.為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理。
3.每次實驗應該設置陰、陽性對照。
4.試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心。
5.試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在一次使用前應全部轉移至標本準備區(qū)，并單獨存放。
6.為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記。
7.儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9.實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。
曲霉PCR定量試劑盒儲存條件：
4℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心0分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。
3.細胞上清液：3000轉離心0分鐘去除顆粒和聚合物。
4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心0分鐘取上清。
5.保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
反應五要素：
參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 5-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至0kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
引物量：每條引物的濃度0.～umol或0～00pmol，以*引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
運輸及保存：低溫運輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽性對照需要單獨放置，不要污染其他試劑。
自備試劑：樣品 DNA。
