大鼠環(huán)磷酸鳥苷ELISA試劑盒使用說明書

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中cGMP水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入cGMP抗原、化的抗大鼠cGMP抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的cGMP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

.酶聯(lián)板：一塊（96孔）

標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至ml，蓋好后靜置0分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為00ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成00ng/mL，50ng/mL，25ng/mL，2.5ng/mL，6.25ng/mL，3.ng/mL，.56ng/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0ng/mL，臨用前5分鐘內(nèi)配制。

如配制50ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml00ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

2.樣品稀釋液：×20ml/瓶。

3.檢測稀釋液A：×0ml/瓶。

4.檢測稀釋液B：×0ml/瓶。

5.檢測溶液A：×20ul/瓶（：00）臨用前以檢測稀釋液A：00稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔00ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.-0.2ml。如ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

6.檢測溶液B：×20ul/瓶（：00）臨用前以檢測稀釋液B：00稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

7.底物溶液：×0ml/瓶。

8.濃洗滌液：×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

9.終止液：×0ml/瓶（2NH2SO4）。

標(biāo)本的采集及保存

．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于000xg離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C000xg離心5分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品00ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)20分鐘。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。

3.每孔加檢測溶液A工作液00ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.每孔加檢測溶液B工作液00ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。

5.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。

6.依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
注意事項(xiàng)

．洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，使用排槍加樣。

3．請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

4．如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計(jì)算時(shí)請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時(shí)，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

6．底物請避光保存。

檢測范圍：

.56ng/mL-00ng/mL

說明

．試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

2．有效期：6個(gè)月

3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

5．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。