今天我們給大家?guī)?lái)的是細(xì)胞凋亡過(guò)程中我們有哪些指標(biāo)的檢測(cè)。

01class細(xì)胞凋亡早期

細(xì)胞凋亡比較早期時(shí)，細(xì)胞膜即出現(xiàn)了一些改變，細(xì)胞膜磷脂雙分子層中的磷脂酰*從細(xì)胞膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外，暴露于細(xì)胞膜；Annexin V 是一種Ca2+依賴(lài)的磷脂結(jié)合蛋白，在Ca2+存在的情況下，與磷脂酰*有很高的親和力，因此Annexin V是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。當(dāng)AnnexinV 被熒光素標(biāo)記時(shí)，可在流式細(xì)胞儀上或熒光顯微鏡下檢測(cè)到早期凋亡的細(xì)胞。同時(shí)，也可以利用PS外翻到胞外，利用其PS抗體進(jìn)行檢測(cè)。

02class細(xì)胞凋亡中期

天冬氨酸特異性半*蛋白酶，通常以無(wú)活性的原酶形式存在于細(xì)胞中。其中Caspase 2、8、9及10作為起始Caspases，Caspase 3、6、7作為執(zhí)行Caspases。在細(xì)胞凋亡中期，效應(yīng)的caspases會(huì)被激活，可以通過(guò)檢測(cè)凋亡細(xì)胞的caspases活性及篩選caspases的激活劑或抑制劑，達(dá)到檢測(cè)caspases活性的目的。其檢測(cè)可以利用免疫捕獲法、抑制劑結(jié)合法及抗體WB檢測(cè)法。關(guān)于篩選凋亡的指標(biāo)進(jìn)行WB檢測(cè)法，Arigo提供了細(xì)胞凋亡指標(biāo)的抗體對(duì)，相同的價(jià)格可以購(gòu)買(mǎi)兩支抗體。如Apoptosis Marker Antibody Duo (Caspase3, PARP)及Mitochondria Apoptosis Initiator Antibody Duo (APAF1, Cytochrome c)。

03class細(xì)胞凋亡晚期

細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3‘-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或*形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類(lèi)方法稱(chēng)為TUNEL法。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被染色。

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DNA的片段化檢測(cè)：組成染色質(zhì)的DNA鏈被激活的核酸內(nèi)切酶切割，可形成180-200bp或其整倍數(shù)的片段化，電泳中呈特征性的“梯”狀條帶，這是判斷凋亡發(fā)生的客觀(guān)指標(biāo)之一。

04class線(xiàn)粒體相關(guān)凋亡檢測(cè)方法

線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)：使用一種陽(yáng)離子染料（JC-1），該染料在正常細(xì)胞內(nèi)聚集在線(xiàn)粒體內(nèi)，形成多聚體，發(fā)鮮紅色熒光；而在凋亡細(xì)胞內(nèi)，由于線(xiàn)粒體膜電位的破壞，不能進(jìn)入線(xiàn)粒體內(nèi)，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。因此，根據(jù)紅綠熒光可以方便地區(qū)分正常和凋亡細(xì)胞。利用熒光顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號(hào)。

*的檢測(cè)：*（cytochrome c ）位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜和外膜之間，在外界凋亡刺激物的作用下，可以從線(xiàn)粒體釋放到胞質(zhì)內(nèi)，并與胞質(zhì)中的Apaf-1結(jié)合。*/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，即而激活caspase-3及其下游的caspases，啟動(dòng)凋亡過(guò)程。從細(xì)胞質(zhì)中分離富線(xiàn)粒體的組分，然后用試劑盒的* 抗體，通過(guò)Fluorescent、Western Blot方法檢測(cè)* 從線(xiàn)粒體到細(xì)胞質(zhì)的釋放。

*（GSH）檢測(cè)：許多細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞漿內(nèi)的谷光苷肽（GSH）水平會(huì)降低，此現(xiàn)象發(fā)生在細(xì)胞凋亡非常早的階段，因此檢測(cè)*的水平可以早期判斷和檢測(cè)凋亡。

NO( 一氧化氮) 檢測(cè)：NO 參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，凋亡細(xì)胞中NO 的合成速度遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，因此檢測(cè)凋亡細(xì)胞中的NO水平有助于更好的了解NO對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。 NO 均被氧化為亞硝酸鹽(NO2-)和亞硝酸鹽(NO3-)，用這些陰離子的濃度可用來(lái)定量所產(chǎn)生的NO的濃度。

05class凋亡相關(guān)信號(hào)通路分子的檢測(cè)

Bcl-2家族活性檢測(cè)

組蛋白H2A.X和H2B：凋亡發(fā)生時(shí)會(huì)發(fā)生染色質(zhì)DNA的濃集，濃集的DNA可以被caspase相關(guān)的DNA酶斷裂，同時(shí)組蛋白H2B的14位絲氧酸發(fā)生磷酸化修飾。組蛋白H2B的14位*發(fā)生磷酸化修飾是凋亡不可逆進(jìn)展的重要標(biāo)志

端粒酶活性檢測(cè)試劑盒

06class凋亡抑制劑和誘導(dǎo)劑凋亡誘導(dǎo)劑如放xian菌素(actinomycin），*(camptothecin)，放xian菌酮(cyclotleximide)，*(dexamethasone)，足葉已甙(etoposide)等。07class凋亡分析的總體原則

因?yàn)榈蛲鍪嵌嘁蛩?、多通路參與的過(guò)程，不能根據(jù)單一指標(biāo)來(lái)判斷調(diào)亡；所以需進(jìn)行多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)。

由于凋亡細(xì)胞不同時(shí)間出現(xiàn)的凋亡事件不同；而每個(gè)指征維持有一段，所以需要在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采樣，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實(shí)驗(yàn)需要設(shè)定陽(yáng)性和陰性對(duì)照，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性

根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象（材料）的具體情況、設(shè)備配套等選擇可行的方案

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