給各位小伙伴腦補(bǔ)一下非特異性擴(kuò)增，即進(jìn)行PCR所擴(kuò)增出來的條帶不是所要的，引物與模板在非目的條帶處有錯(cuò)配，導(dǎo)致延伸產(chǎn)物不是目的條帶。例如引物二聚體，即引物在退火過程中產(chǎn)生了hairpin結(jié)構(gòu)或其他二級(jí)結(jié)構(gòu)，或者引物在模板的某些位置非特異性地結(jié)合，也同樣會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。　

　　我們都知道，PCR產(chǎn)物都是通過引物延伸產(chǎn)生的。當(dāng)引物產(chǎn)生了二聚體或者非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物之后，引物本身就無法再延伸形成PCR產(chǎn)物了，這樣的情況下，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物越是多，那目的產(chǎn)物就越是少。如果在qPCR過程中，就會(huì)在熔解曲線中形成雙峰。　　

　　小伙伴們遇到這樣的問題，首先想到的可能是加入DMSO來阻止引物二聚體形成，或者EDTA來調(diào)節(jié)體系的離子濃度。但是具體問題具體分析，我們不能病急亂投醫(yī)，這里老談給小伙伴們整理了解決方法，希望可以幫助大家快速、準(zhǔn)確的搞定這個(gè)“小問題”。

　?。?、引物設(shè)計(jì)的過程中要用Primer premier 5.0來驗(yàn)證一下二聚體；

　　2、 引物合成后，先做一次梯度PCR，檢測zui合適的退火溫度，一般高退火溫度可以提高引物對(duì)模板的特異性從而降低引物二聚體；

　　3、 降低Mg2+濃度，鎂離子濃度高，會(huì)導(dǎo)致大量的非特異性擴(kuò)增，但是沒有鎂離子的話，也會(huì)導(dǎo)致Taq酶的失活；

　　4、降低dNTP濃度，dNTP也是非特異性擴(kuò)增的一個(gè)罪魁禍?zhǔn)?，降低它的濃度，也能有效降低二聚體及其他非特異性擴(kuò)增；

　　5、降低引物濃度，一般的PCR引物都是過量的，降低了引物濃度自然也能降低引物之間形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性；

　　6、提高退火溫度，這個(gè)道理很簡單，引物的退火溫度提高，引物間的二級(jí)結(jié)構(gòu)形成可能性就會(huì)降低；

　　7、延長退火時(shí)間，這個(gè)也可以減弱引物間結(jié)合的可能性；

　　8、DMSO及甜菜堿，這些PCR促進(jìn)劑，主要是用于CG含量高的模板上，降低DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，但根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，加入DMSO之后需要同時(shí)提高一點(diǎn)退火溫度來補(bǔ)平（qPCR不太適用）；

　　9、熱啟動(dòng)法，通過95℃的高溫?zé)釂?dòng)，高溫解鏈，使得引物間的二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，以此降低二聚體產(chǎn)生。

SW48
SW480
SW579
SW620
SW626
SW837
SW872
SW1116
SW1222
SW1463
SW1990
SZ95
T CELL
T HESCS
T2
T3A
T24
T-47D
T84
T98G
TALL-104
TC-1
TCA8113
TCAM-2
TCCSUP
TCMK-1
TE 354.T
TE-1
TE-3
TE-6
TE-10
TE-22
TE-13
TE671
TEV-1
TF-1
TFK-1
TH-1
TH17
THC 8307
THLE-2
THLE-3
THP-1
THP-2
TJ905
TK-1
TM3
TM4
TMD8
TOV-21G
TOV-112D
TPC-1
TR146
TREG
TT
TT2609-C02
TU212
TU686
TUL-1
U-2 OS
U14
U27
U87
U-87MG
U-118MG
U251
U266
U343 MGA