科研實(shí)驗(yàn)都離不開(kāi)細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)的好壞關(guān)乎實(shí)驗(yàn)的zui終結(jié)果，下面我們整理了一些難養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法.

1）球體細(xì)胞培養(yǎng)：

1. 瓊脂鋪底的培養(yǎng)瓶：30ml無(wú)菌培養(yǎng)瓶，每瓶中加5ml 2%瓊脂培養(yǎng)基，冷卻，形成平坦底層后備用。 
2.取生長(zhǎng)狀態(tài)良好已連接成片的細(xì)胞，用彎頭吸管伸入瓶?jī)?nèi)，把細(xì)胞縱橫割劃成若干小區(qū)后，倒出培養(yǎng)液。 
3.加入0.25%的*液，在倒置顯微鏡下邊消化邊觀察，當(dāng)細(xì)胞小區(qū)邊緣微卷起后便立即終止消化，倒出消化液，用Hanks輕輕漂洗一次，加入新培養(yǎng)液3~5 ml，用吸管把已松動(dòng)的細(xì)胞片吸打下來(lái)，分裝入1~3個(gè)含2%瓊脂培養(yǎng)基底層的培養(yǎng)瓶中，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，數(shù)日后便可生長(zhǎng)成細(xì)胞球體。 
4.換液：培養(yǎng)1~2日后，如需換液，微傾斜培養(yǎng)瓶，令培養(yǎng)液集于培養(yǎng)瓶底角，停片刻，待球體細(xì)胞下沉后，吸除部分培養(yǎng)液，再補(bǔ)充新培養(yǎng)液。 

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（cat.No.M7540）

2）胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

用人或動(dòng)物胚體為好；動(dòng)物可用小鼠或雞胚，去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用*消化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。幼兒bao皮是培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的很好對(duì)象。 

大鼠巨噬細(xì)胞（Cat.No.R1920）

3）巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

1．實(shí)驗(yàn)前三天，向每只大鼠腹腔內(nèi)注入無(wú)菌硫羥乙酸肉湯1ml（勿注入腸內(nèi)）。

2．引頸殺死動(dòng)物，手提鼠尾將全鼠浸入70％酒精中3～5秒。

3．置動(dòng)物于解剖臺(tái)上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開(kāi)皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。

4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時(shí)從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)。

5．用針頭輕輕挑起腹壁，使動(dòng)物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)。

6．小心拔出針頭，把液體注入離心管中，250g 4℃離心10分鐘，去上清，加10 ml Eagle培養(yǎng)基。

7．計(jì)數(shù)細(xì)胞，每只小鼠可產(chǎn)生20～30×105細(xì)胞，其中90％為巨噬細(xì)胞。

8．為獲取3×105個(gè)帖附細(xì)胞/平方厘米，需接種2.5×106/ml。

9．為純化培養(yǎng)細(xì)胞，去除其它白細(xì)胞，接種數(shù)小時(shí)后，去除培養(yǎng)液，用Eagle液沖洗1～2次后，再加新Eagle培養(yǎng)液置37℃ CO2溫箱中培養(yǎng)。

人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（Cat.No.4650）

4）軟骨細(xì)胞培養(yǎng)：

骨細(xì)胞內(nèi)含許多細(xì)胞因子及其受體，且表明許多細(xì)胞因子通過(guò)自分泌或旁分泌兩種基本方式來(lái)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞。目前認(rèn)為促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成代謝的細(xì)胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，對(duì)軟骨細(xì)胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等

體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是可以大量擴(kuò)增及研究其生命活動(dòng)的狀況，但要維持其正常表型則 受到眾多復(fù)雜因素的調(diào)控。就其細(xì)胞因子而言，細(xì)胞因子對(duì)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的作用非單一的，而是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，如生長(zhǎng)因子的生物學(xué)活性是由受體介導(dǎo)的，生長(zhǎng)因子在 軟骨細(xì)胞合成分泌后，多為無(wú)活性的前體分子需要經(jīng)過(guò)特異性的激活才能發(fā)揮作用。生長(zhǎng)因 子之間存在基因表達(dá)及其活性的相互調(diào)控TGF-β能促進(jìn)PDGF的A鏈和B鏈的mRNA表達(dá)和分泌 ［30］。bFGF能促進(jìn)TGF-β mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，增強(qiáng) TGF對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖及其基質(zhì)合成作用。生長(zhǎng)因子之間還存在受體水平的調(diào)控，胰島素不 影響TGF-Ⅱ型受體的親和力但增加了Ⅱ型受體的數(shù)目引起受體上調(diào)效應(yīng)，從而Ⅱ型受體與 Ⅰ型受體競(jìng)爭(zhēng)，使胰島素與Ⅰ型受體結(jié)合減少。IL-1可使TNF受體下調(diào)，而IFN-γ卻使TNF 受體上調(diào)等。但是生長(zhǎng)因子如何調(diào)控體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的增殖、分化阻滯反分化或向肥 大型轉(zhuǎn)化、維持其正常軟骨細(xì)胞表型及合成特異性胞外基質(zhì)還需進(jìn)一步的研究。總之軟骨細(xì) 胞體外培養(yǎng)維持其正常表型則受到眾多因素的影響如培養(yǎng)條件及其方式，細(xì)胞的微環(huán)境，PH 值、細(xì)胞密度、力學(xué)變化、生長(zhǎng)因子等等。

5）微載體細(xì)胞培養(yǎng)法  
1.微載體選擇：先用利用三種小量微載體做培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的吸著率和計(jì)算細(xì)胞數(shù)，以得到zui大量細(xì)胞為佳。  
2.水化：稱一定量的微載體放入容器中，按每克微載體加50～100ml的比例，加入無(wú)Ca2＋和Mg2＋的磷酸緩沖液（PBS），室溫下放置應(yīng)不少于3小時(shí)，并不時(shí)輕微攪動(dòng)，然后再用新鮮PBS洗一次。  
3. 消毒：可采用高壓蒸汽消毒，也可在水化后用70％酒精浸泡消毒，再用無(wú)菌的PBS漂洗一二次。 
4.傳代培養(yǎng)：在連續(xù)進(jìn)行微載體培養(yǎng)時(shí)，可以不必把細(xì)胞從微載體分離下來(lái)，可將帶有細(xì)胞的微載體和新的微載體混合進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞能移動(dòng)到新載體上。如果進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)或需要分離細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，和常規(guī)培養(yǎng)相同，先用EDTA＋*溶液作用使細(xì)胞脫離微載體表面。細(xì)胞脫離微載體后，可用自然沉降法，即在室溫下靜止5分鐘，微載體將先自沉在底部，細(xì)胞大部分仍在上清中，然后離心上清即可得到細(xì)胞。如果需要分離程度較高時(shí)，需用孔徑為100微米的尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾后，再離心濾過(guò)液，就可得到較純凈的細(xì)胞。