酶切是分子生物學中常用的，如何選擇酶切緩沖液，提高酶切效率，是一個十分關(guān)鍵的問題，本人摘用了其它論壇的內(nèi)容，另外將逐步整理，使酶切問題能夠比較容易解決，希望大家補充：
PCR產(chǎn)物的酶切。
PCR產(chǎn)物的酶切與引物上引入的保護堿基有很大的關(guān)系，所以設(shè)計引物的時候就應(yīng)該注意到這一點，如何選擇保護堿基，具體參見NEB上關(guān)于保護堿基的資料：
加了保護堿基可能也會遇到切不動的問題，切不動可以從以下方面考慮：(1)酶切緩沖液、每種酶都有公司提供的*緩沖液，它們的差別只是離子濃度與體系的不同，如Na、k、Mg等，還有PH值及緩沖體系(一般Tris-HCl)，另外酶加甘油和DTT作為保護劑。在雙酶切的時候常會遇到兩種酶有各自的緩沖液，要達到高酶切效率，選擇是個問題，如果酶切時間和量足夠，解決的方法：
(A)使用其中一個酶的緩沖液，但要考慮到另一酶的反應(yīng)效率，反應(yīng)效率如何，可以查查酶在不同buffer里的效率參數(shù)，具體見公司，如NEB提供了很好的buffer參數(shù)：
(B)使用它們的通用的緩沖液，使兩種酶在同一緩沖液里達到也足夠的酶切效率；沒有通用的BUFFER怎么辦呢？
分兩次酶切。即先用一種酶切，膠回收后再用另一種酶切。一般先低鹽后高鹽，這種方法保證了在各自的酶切緩沖液中都得到zui大的酶切效率，但缺點是要回收，損失大 ；
(C)克隆到T載體中，值得推薦的方法，克隆到T載體中，不須要考慮受這個條件的限制，酶切位點也可以用T載體上自帶的。
(2)酶切溫度。酶切溫度也很重要，一般的酶切zui適溫度為37度，有些特殊的酶的反應(yīng)溫度不同，如Sma Ⅰ為30度。雙酶切時這種情況下分開切，先低溫后高溫。
(3)酶切時間。酶切時間直接影響到酶切是否，一般為1-3h，這個時間已經(jīng)足夠，對于一些活性較好的酶，30min就可以酶切，建議在酶切1h后取5ul跑電泳以鑒定酶切效率；PCR產(chǎn)物的酶切時間較長，一般24小時。
(4)酶失活。如果使用酶解凍后放置太久，可能導(dǎo)致酶失活。這種情況較少見，只能換新酶。如果拿了不同公司的酶，buffer也不一樣，怎么辦？放心，可以用不同公司的酶進行雙酶切，一般不會有問題的。可以先查查NEB的酶在不同緩沖液中的活性百分比，選擇它們都有適中活性的buffer，每個公司生產(chǎn)的酶反應(yīng)緩沖液針對特定內(nèi)切酶是zui合適的！
(5)酶切體系。選用多大的酶切體系取決于你的樣品濃度，在雙酶切的時候為了得到質(zhì)量高的電泳圖，尤其插入的是小片段DNA，酶切后產(chǎn)物量較少，可以增加酶切重組DNA的量和增加上樣量，建議酶切前測定一下DNA濃度或跑電泳看看DNA有多濃，做到心中有數(shù)。
