在設(shè)計IHC/ICC實驗時，一抗的選擇是相當(dāng)重要的。IHC/ICC實驗的所有步驟都必須經(jīng)過優(yōu)化，以便觀察到特異染色，并盡可能減少非特異的背景染色。這包括開展預(yù)實驗，以確定每個一抗的適當(dāng)孵育條件?？乖H和純化的多克隆抗體的稀釋度通常低于單克隆抗體，但這些值必須根據(jù)經(jīng)驗確定。為了獲得可靠特異的信號，應(yīng)采用交叉反應(yīng)性極少的高質(zhì)量抗體。
一抗孵育的起始條件
單克隆抗體
多克隆抗體
組織
5-25 µg/mL，4 °C孵育guoye
1.7-15 µg/mL，4 °C孵育guoye
細(xì)胞5-25 µg/mL，室溫下1小時
1.7-15 µg/mL，室溫下1小時
優(yōu)勢
單表位特異性
所需濃度較低
限制
易受表位遮蔽的影響選擇一抗供應(yīng)商
在搜索一抗時，產(chǎn)品很可能有幾個不同的商業(yè)來源，而它們的抗體質(zhì)量可能參差不齊。zui初的選擇也許決定了這是個成功的實驗，抑或是個錯失的機(jī)會。*步是尋找獨立驗證。這包括在文獻(xiàn)中檢查抗體過去是否成功使用。許多供應(yīng)商（包括R&D Systems）都可以為尋找這一信息的研究人員提供協(xié)助。另一個問題是詢問抗體是否真的由供應(yīng)商制造，還是它采購了之后轉(zhuǎn)售？直接購買確保了商業(yè)來源對制造、質(zhì)量控制流程、以及運(yùn)輸和儲存條件的*控制。此外，一旦抗體的使用出現(xiàn)問題，制造商會處于提供技術(shù)服務(wù)的*地位。
選擇單克隆還是多克隆抗體
單克隆和多克隆抗體的內(nèi)在特征決定了它們用于IHC/ICC時的優(yōu)勢和限制。單克隆抗體由單個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生，代表了同質(zhì)群體，能夠高親和力高特異性地與單個表位結(jié)合。這在檢測蛋白家族的某個成員時特別有用，因為蛋白家族有著高比例的氨基酸同源性。
抗體結(jié)合往往依賴于目標(biāo)蛋白維持其天然的構(gòu)想狀態(tài)。與其他蛋白的相互作用、翻譯后修飾、溫度、pH、固定和鹽濃度都會影響抗體接近目的表位。多克隆抗體是異質(zhì)的，可識別多個表位，因此它們較少受到蛋白構(gòu)象變化的影響。一般而言，多克隆抗體在一定pH和鹽濃度范圍內(nèi)也比單克隆抗體更為穩(wěn)定?；谶@些原因，多克隆抗體更常用于IHC/ICC實驗。
多克隆抗體的親和純化
多克隆抗血清是抗體混合物，它們由大量B細(xì)胞克隆產(chǎn)生。組成多克隆抗血清的抗體以不同的特異性和親和力與目標(biāo)表位結(jié)合，也與不相關(guān)的目標(biāo)分子交叉反應(yīng)（非特異相互作用）。為了富集與目的抗原特異性和親和力zui高的抗體，R&D Systems的多克隆抗體經(jīng)過抗原親和純化。在此過程中，多克隆抗血清流過包含固定化抗原分子的親和柱。特異抗體被固定化抗原保留，而非特異抗體流過柱子，被丟棄。隨后從柱子上洗脫經(jīng)抗原親和純化的抗體?？乖H和純化的抗體主要與目的抗原相互作用，降低了背景染色，與未純化抗體相比產(chǎn)生了更一致的結(jié)果。
一抗孵育的優(yōu)化
一抗?jié)舛?、稀釋液、孵育時間和溫度都影響了染色質(zhì)量。這些變量需要針對每個抗體和樣品來優(yōu)化，以便實現(xiàn)特異染色和低背景。優(yōu)化通常是保持孵育時間和溫度不變，而改變抗體濃度，以確定何時獲得*信號和低背景噪音。例如，如果使用高親和力的抗體，那么相對較高的濃度可能需要較短的孵育時間。相反，較低的抗體濃度可能需要較長的孵育時間。人們通常采用較長的孵育時間，以確保抗體*滲透到體視學(xué)技術(shù)所用的組織切片。為了促進(jìn)特異染色，較長時間的孵育通常在低溫下開展（即4 °C vs 室溫）。
R&D Systems組織切片染色方案的優(yōu)化通常是從一抗在4 °C孵育guoye開始的。對于細(xì)胞染色，人們通常選擇在室溫下與一抗共同孵育1小時。抗原親和純化過的多克隆抗體的工作濃度（1.7-15 µg/mL）通常比單克隆抗體（5-25 µg/mL）要低。在比較不同濃度的相同抗體染色的樣品時，在孵育步驟時必須使用一致的時間和濃度。當(dāng)*次使用新抗體時，建議開展預(yù)實驗，檢驗各種抗體濃度。
