適當(dāng)?shù)膶?duì)照對(duì)于IHC/ICC結(jié)果的準(zhǔn)確闡釋至關(guān)重要。令人滿意的IHC/ICC實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可產(chǎn)生結(jié)果，說(shuō)明抗原位于正確的組織、細(xì)胞類(lèi)型或亞細(xì)胞定位。固定、封閉、抗體孵育和抗原修復(fù)步驟的優(yōu)化將產(chǎn)生強(qiáng)烈而特異的信號(hào)。然而，有時(shí)實(shí)驗(yàn)也會(huì)出現(xiàn)假象哦，蒙蔽了你的雙眼。因此，IHC/ICC實(shí)驗(yàn)必須包含陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
此外，抗體特異性、實(shí)驗(yàn)條件、組織類(lèi)型之間生物學(xué)條件、甚至研究人員的差異都可能產(chǎn)生不一致的染色，導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)論。為了實(shí)現(xiàn)性能一致，詳細(xì)記錄是IHC/ICC研究的一個(gè)重要因素。在此，我們介紹了一些*的對(duì)照，可支持您IHC/ICC結(jié)果的特異性。
內(nèi)源組織背景對(duì)照
某些細(xì)胞和組織可能有著固有的生物學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)生背景染色，從而導(dǎo)致結(jié)果的誤讀。在一抗上樣之前，應(yīng)利用熒光（適用于熒光標(biāo)記）或明視場(chǎng)（適用于顯色標(biāo)記）照明在顯微鏡下檢查細(xì)胞和組織，以確保組織本身沒(méi)有信號(hào)。例如，脂褐質(zhì)是一種內(nèi)源的自發(fā)熒光色素，可與陽(yáng)性染色混淆。
無(wú)一抗對(duì)照
將組織與抗體稀釋液孵育，其中不包含一抗的對(duì)照通常也是必需的。之后與二抗和檢測(cè)試劑孵育。只用檢測(cè)試劑染色應(yīng)該是可以忽略的，它不會(huì)掩蓋特異染色，也不會(huì)類(lèi)似于特異染色的模式。
同型對(duì)照
在使用單克隆一抗時(shí)，可利用此對(duì)照。將樣品與抗體稀釋液孵育，并添加與一抗相同亞型（如IgG1、IgG2A、IgG2B、IgM）和濃度的非免疫球蛋白。之后將樣品與二抗和檢測(cè)試劑孵育。這些步驟將確保特異染色所出現(xiàn)的不是由免疫球蛋白分子與樣品的非特異相互作用引起的。背景染色應(yīng)該是可以忽略的，與特異染色不同。
吸附對(duì)照
體與免疫原預(yù)孵育。這會(huì)使抗體失活，組織應(yīng)該無(wú)染色或很少染色?？乖c抗體的混合物應(yīng)以10:1（摩爾比）配制，并在4 °C預(yù)孵育guoye。
隨后將預(yù)吸附的抗體與組織共同孵育，以取代一抗。將一抗產(chǎn)生的染色模式與預(yù)吸附抗體產(chǎn)生的相比較。
如果免疫原是肽段，那么吸附對(duì)照效果更好。不過(guò)，如果抗體是由整個(gè)蛋白產(chǎn)生的，則抗體與蛋白混合物的添加可能導(dǎo)致更高的非特異染色。盡管機(jī)理還不清楚，但有可能是預(yù)吸附所用的抗原本身與組織結(jié)合，產(chǎn)生非特異染色。因此，必須注意，使用整個(gè)蛋白的吸附對(duì)照不一定能驗(yàn)證抗體與組織中蛋白結(jié)合的特異性。
大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的吸附對(duì)照。A. 利用anti-human phospho-MSK1親和純化過(guò)的多克隆抗體（貨號(hào)AF1036）對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)冰凍切片中的磷酸化MSK1（S212）進(jìn)行染色。B. 如果抗體用S212磷酸化免疫原預(yù)先吸附，則細(xì)胞核染色（箭頭所指）不見(jiàn)了。
組織類(lèi)型對(duì)照
IHC/ICC實(shí)驗(yàn)的其他對(duì)照包括使用已知表達(dá)（或不表達(dá)）目的表位的組織樣品。這種策略可提供有用的參考，也可使用在初步優(yōu)化研究中。來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的組織特別有用，它們表達(dá)或不表達(dá)抗原。此外，不同物種的組織樣品也可包含在內(nèi)，以支持抗體的物種特異性。
Western Blot有必要嗎？
人們常常開(kāi)展Western blot實(shí)驗(yàn)，以補(bǔ)充或支持IHC/ICC研究。不過(guò)，在變性過(guò)程中蛋白構(gòu)象的變化可能產(chǎn)生誤導(dǎo)性的結(jié)果。對(duì)于某一特定抗體，Western blot與IHC/ICC研究之間的不一致可能只是反映出實(shí)驗(yàn)條件的差異。由于多克隆抗體識(shí)別多個(gè)表位，故沒(méi)那么容易產(chǎn)生這種實(shí)驗(yàn)假象。
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