一、基本原理
厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類繁多，作用也日益引起重視。培養(yǎng)厭氧微生物的技術(shù)關(guān)鍵是要使該類微生物處于除去了氧或氧化還原勢(shì)低的環(huán)境中。
焦性沒(méi)食子酸與堿性溶液作用后，形成堿性沒(méi)食子酸鹽，在此反應(yīng)過(guò)程中能吸收氧氣而造成厭氧環(huán)境；牛肉渣內(nèi)既含有不飽和脂肪酸能吸收氧，又含有*（glutathione）能形成負(fù)氧化還原電位差；厭氧罐是采用某種方法除去其中的氧，例如將鎂與氧化鋅制成產(chǎn)氫氣袋，放入罐中加水反應(yīng)產(chǎn)生氫，鈀或鉑是催化劑，在常溫下催化氫與氧化合成水，則可除去密封的厭氧罐中的氧。
二、器材
巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭狀芽孢桿菌，Clostridium pas- teurianum），熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）；
焦性沒(méi)食子酸，棉花，10%NaOH，滅菌的石蠟凡士林（1∶1），牛肉，蛋白陳，葡萄糖， NaCl，肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，小試管肉膏蛋白胨瓊脂斜面，厭氧罐，催化劑袋，氣體發(fā)生袋，指示劑袋，滅菌的帶橡皮塞或螺旋帽的大試管，滅菌的玻璃板（直徑比培養(yǎng)皿大3—4 cm），滅菌的滴管，燒瓶，刀等。
三、操作步驟
1．焦性沒(méi)食子酸法
?。?）大管套小管法在大試管中放入少許棉花和焦性沒(méi)食子酸，焦性沒(méi)食子酸的用量按它在過(guò)量堿液中能每克吸收100ml空氣中的氧來(lái)估計(jì)，本實(shí)驗(yàn)用量約0．5g。接種巴氏芽孢梭菌在小試管肉膏蛋白胨瓊脂斜面上，迅速滴入10％的NaOH于大試管中，使焦性沒(méi)食子酸潤(rùn)濕，并立即放入除掉棉塞已接種菌的小試管斜面（小試管口朝上），塞上橡皮塞或擰上螺旋帽，置30℃培養(yǎng)。
?。?）培養(yǎng)皿法取玻璃板一塊或用培養(yǎng)皿蓋，鋪上一薄層滅菌脫脂棉，將1g焦性沒(méi)食子酸放于其上。用肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基倒平板，待凝固稍干燥后，在平板上一半劃線接種巴氏芽孢梭菌，下一半劃線接種熒光假單胞菌，并在皿底用記號(hào)筆作好標(biāo)記。滴加10％NaOH溶液約2ml于焦性沒(méi)食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即將已接種的平板覆蓋于玻璃板上或培養(yǎng)皿蓋上，必須將脫脂棉全部罩住，焦性沒(méi)食子酸反應(yīng)物切勿與培養(yǎng)基表面接觸，以溶化的石蠟凡士林液（即vaspar）密封皿底與玻璃板或皿蓋的接觸處。置30℃溫箱培養(yǎng)。
2．皰肉培養(yǎng)基法
（1）取已除去筋膜、脂肪的牛肉500g，切成小方塊，置1000ml蒸餾水中，以小火煮1小時(shí)，用紗布過(guò)濾，擠干肉汁，將肉汁保留備用。再將肉渣用絞肉機(jī)絞碎，或用刀切碎，使其成細(xì)粒。
?。?）將保留的肉汁加蒸餾水，使總體積為2000ml，加入20g蛋白陳，2g葡萄糖，5gNaCl和絞碎的肉渣。置燒瓶中搖均勻，加熱使蛋白胨溶化。
（3）取上層溶液調(diào)整pH為8．0，在燒瓶壁上用記號(hào)筆標(biāo)明瓶?jī)?nèi)液體高度，1．05kg/cm2，121．3℃滅菌15分鐘后補(bǔ)足蒸發(fā)的水量，重新調(diào)整pH為8．0，再煮沸10—20分鐘，補(bǔ)足水量，再調(diào)整pH為7．4。
?。?）把燒瓶?jī)?nèi)容物搖勻，將溶液和肉渣分裝于小試管中，肉渣約用，應(yīng)用無(wú)菌手續(xù)加入已滅菌的石蠟凡士林，以隔絕氧氣。
?。?）接種前可將上述已做好的庖肉培養(yǎng)基煮沸10分鐘，以除去溶入的氧，如果蓋有一層石蠟凡士林，需將石蠟凡士林先在火焰邊微加熱，使其溶化。在培養(yǎng)基手感不燙時(shí)按液體接種法接入巴氏芽孢梭菌，然后將接種的試管垂直，使石蠟凡士林凝固而密封培養(yǎng)基。再置30℃中培養(yǎng)。
3．厭氧罐培養(yǎng)法
?。?）用肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平板，凝固干燥后，取兩個(gè)平板，每個(gè)平板一半邊劃線接種巴氏芽孢梭菌，另一半邊劃線接種熒光假單胞菌，并標(biāo)記好。取其中的一個(gè)已接種的平皿置于厭氧罐的培養(yǎng)皿支架上，而后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐內(nèi)；另一個(gè)已接種的平皿置培養(yǎng)室30℃培養(yǎng)。
?。?）剪開(kāi)催化劑袋，將催化劑倒入?yún)捬豕奚w下面的多孔催化劑盒內(nèi)，擰緊催化劑盒的盒蓋。
?。?）剪開(kāi)氣體發(fā)生袋的切碎線處，并迅速將此氣體發(fā)生袋置罐內(nèi)金屬架的夾上，再向袋中加入約10 ml水。同時(shí)，由另一人配合，剪開(kāi)指示劑袋，將指示條暴露，立即放進(jìn)罐內(nèi)。
?。?）迅速蓋好厭氧罐的蓋，將固定梁旋緊，置 30℃培養(yǎng)，如圖Ⅶ-11所示。
四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告
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