一、基本原理
在土壤、水、空氣或人及動(dòng)、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。
為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長(zhǎng)，而抑制其他菌生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。
土壤是微生物生活的大本營(yíng)，在這里生活的微生物無(wú)論是數(shù)量和種類都是極其多樣的，因此，土壤是我們開(kāi)發(fā)利用微生物資源的重要基地，可以從其中分離、純化到許多有用的菌株。
二、器材
高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基，肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，盛9ml無(wú)菌水的試管，盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，無(wú)菌玻璃涂棒，無(wú)菌吸管，接種環(huán)，10％酚，無(wú)菌培養(yǎng)皿，*，土樣等。
三、操作步驟
1．稀釋涂布平板法
?。?）倒平板 將肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基溶化，待冷至55—60℃時(shí)，向高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基中加入10％酚數(shù)滴，向馬丁氏培養(yǎng)基中加入*溶液，使每毫升培養(yǎng)基中含*30μg。然后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿，其方法是右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角燒瓶，置火焰旁邊，左手拿平皿并松動(dòng)試管塞或瓶塞，用手掌邊緣和小指、無(wú)名指夾住拔出，如果試管內(nèi)或三角燒瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基一次可用完，則管塞或瓶塞不必夾在手指中。試管（瓶）口在火焰上滅菌，然后左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可將平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夾住管塞并打開(kāi)培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖勻后制成平板，如圖Ⅶ-1所示。是將平板放室溫2—3天，或 37℃培養(yǎng)24小時(shí)，檢查無(wú)菌落及皿蓋無(wú)冷凝水后再使用。
（2）制備 土壤稀釋液稱取土樣10g，放入盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20分鐘，使土樣與水充分混合，將菌分散。用一支1ml無(wú)菌吸管從中吸取1ml土壤懸液注入盛有9ml無(wú)菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。然后再用一支1ml無(wú)菌吸管從此試管中吸取1ml注入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各種稀釋度的土壤溶液。
?。?）涂布 將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀釋度，然后用三支1ml無(wú)菌吸管分別由10-4、10-5和10-6三管土壤稀釋液中各吸取0．2ml對(duì)號(hào)放入已寫好稀釋度的平板中，用無(wú)菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，如圖Ⅶ-2所示。
?。?）培養(yǎng) 將高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于28℃溫室中培養(yǎng)3—5日，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)2—3日?！?br /> ?。?）挑菌 將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28℃和37℃溫室中培養(yǎng)，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。整個(gè)分離過(guò)程見(jiàn)圖Ⅶ-3。
2．稀釋混合平板法
此法與稀釋涂布平板法基本相同，無(wú)菌操作也一樣，所不同的是先分別吸取0．5ml10-4、10-5、10-6稀釋度的土壤懸液對(duì)號(hào)放入平皿，然后再倒入溶化后冷卻到45℃左右的培養(yǎng)基，邊倒入邊搖勻，使樣品中的微生物與培養(yǎng)基混合均勻，待冷凝成平板后，分別倒置于28℃和37℃溫室中培養(yǎng)后，再挑取單個(gè)菌落，直至獲得純培養(yǎng)。
3．平板劃線分離法
?。?）按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。
?。?）劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-1的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線（圖Ⅶ-4）。劃線的方法很多，但無(wú)論哪種方法劃線，其目的都是通過(guò)劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使形成單個(gè)菌落。常用的劃線方法有下列二種：
?。╝）用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作*次平行劃線3—4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)*次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線（圖Ⅶ-5，A）。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。
?。╞）將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線（圖Ⅶ-5，B）。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫室培養(yǎng)。
?。?）挑菌 同稀釋涂布平板法，一直到菌分純?yōu)橹埂?br />四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告
會(huì)員1.png)