BCIP／NBT是堿性磷酸酶zui常使用的呈色底物，堿性磷酸酶標記的試劑應(yīng)該用真核生物的堿性磷酸酶，因為這種酶容易被EDTA滅活。細菌酶難以終止其活性，易引起顯色過度，導(dǎo)致較高背景。
BCIP／NBT底物在酶結(jié)合位點形成強烈的黑紫色沉淀，此反應(yīng)是一個穩(wěn)定進行的過程。因此，可設(shè)定一個的反應(yīng)對照?？梢酝ㄟ^孵育時間的長短控制反應(yīng)的敏感性。
1．需要的溶液和特殊設(shè)備
堿性磷酸酶緩沖液：100retool／L NaCl，5mmol／L MgCl2，100mmol／L Tris（pH9．5）；
NBT溶液（0．5gNBT用10ml 70％DMF溶解，貯存在4C）；
BCIP溶液（0．5gBCIP[二鈉鹽]用10m1100％DMF溶解，貯存在413）；
20mmol／LEDTA用PBS溶解，DPX。
光學(xué)顯微鏡（通常帶有照相機以便于記錄結(jié)果）
2．操作步驟
（1）細胞染色前，準備3種貯存液：①NBT：用10ml 70％DMF溶解0．5gNBT；②BCIP：用10ml 100％DMF溶解0．5g BCIP[二鈉鹽兒③堿性磷酸酶緩沖液：100mmol／LNaCl，5mmol／LMgCl2，100mmol／LTris（pH 9．5）。所有的貯存液置4C可保存1年。
（2）實驗前，底物液新鮮配制。加66／ul NBT貯存液至10ml堿性磷酸酶緩沖液中，充分混合，加33ul BCIP貯存液，在1h內(nèi)使用。
（3）將洗滌過的標本片放在一個適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)。加足夠量的底物液覆蓋標本片（3～5ml適合于100mm平皿）。在室溫中進行反應(yīng)直到染色達到適當(dāng)黑色。對一些試劑可在顯微鏡下定期監(jiān)測。一般孵育時間大約是30min。
（4）在含有20mmol／LEDTA的PBS中漂洗以終止反應(yīng)，螯合Mg2+。
（5）優(yōu)化：如果需要，進行復(fù)染。
（6）用水沖洗，DPX封片。
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