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技術文章

ELISA法檢測白細胞介素-10

閱讀:831發(fā)布時間:2010-10-27

IL-10主要由Th2細胞產(chǎn)生,但Tho細胞、Th,細胞、CD8+T細胞、活化的B細胞、單核-巨噬細胞、kupffer細胞、肝細胞、角化細胞等也可產(chǎn)生。IL-10參與抑制細胞合成炎性因子、集落刺激因子(CSF)等主要負反饋調(diào)節(jié)機制,能廣譜抑制單核-巨噬細胞炎性介質(zhì)ILl、IL-6、IL-8、TFN-γ的合成及表達;在免疫反應,可抑制Th:細胞產(chǎn)生細胞因子IL-2、IL-3、TFNγ等,其機制可能是通過與受體結合改變細胞內(nèi)信號的傳導途徑而選擇性抑制有關細胞因子mRNA的合成,IL-10能抑制Th,細胞的增殖及分泌IL-2、TFN-γ等細胞因子,抑制Th:細胞介導的免疫反應。正常肝內(nèi)存在的IL-10就可以通過上述機制或直接拮抗TNF等細胞因子的作用而抑制機體的抗病毒免疫,故有抗肝組織炎性損傷的作用。
[檢測方法] ELISA法
[方法學原理] 在微孔反應板上包被抗人ILlo單克隆抗體,待測標本和標準品中的IL-10會與抗人IL-10單克隆抗體結合,游離的成分被洗去,同時加人*化的抗人IL10抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。*與親和素特異結合,抗人IL-10抗體與結合在單克隆抗體上的人IL-10結合而形成免疫復合物,游離的成分被洗去。加入顯色劑,若反應孔中有IL-10,HRP會使五色的顯色劑呈現(xiàn)藍色,加終止液變黃色。在波長450nm處測吸光度,IL-10濃度與吸光度成正比,可通過繪制標準曲線求出標本中
的IL-10濃度。
[標本準備] 靜脈血2ml,不抗凝。
[試劑]
1.預包被微孔反應板
2.濃縮酶結合物
3.酶結合物稀釋液
4.標準晶和標本稀釋液
5.濃縮*化抗體
6.ILl0標準品
7.濃縮洗滌液
8.顯色劑A、B
9.終止液
[儀器] 酶標儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀。
(檢測步驟)
1.在微孔反應板相應孔中分別加入待測樣本、不同濃度標準品100ul,再加*化抗體工作液50rd。
2.振蕩混勻,置20~25℃環(huán)境中溫育120min。
3.將孔內(nèi)液體吸干,用洗滌液充分洗滌5次,干燥。
4.除空白孔外,加入酶結合物工作液100ul。
5.振蕩混勻,置20-25C環(huán)境中溫育30min。
6.將孔內(nèi)液體吸干,用洗滌液充分洗滌5次,干燥。
7.每孔加入顯色劑A、B各50u1,輕輕振蕩混勻,37℃環(huán)境中避光顯色10min。
8.加入終止液50ul后,輕輕振蕩混勻。用酶標儀(450nm波長)測定各孔吸光度,與標準曲線對照,求出IL-10水平。
[正常參考值] 各實驗室可根據(jù)檢測方法的不同確立正常參考值。
[注意事項]
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用,未用完的微孔條用自封袋密封保存。
2.酶標板洗滌時各孔均需加滿洗滌液,防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應設定30-60s的洗滌浸泡時間。
3.滴加試劑前應將滴瓶翻轉數(shù)次,使液體混勻。滴加時瓶身應保持垂直,以使滴量準確。
4.所有樣品和廢棄物都應按傳染源處理。終止液為2mol/L硫酸,使用時應注意安全。
5.每批樣本應同時做標準曲線。
6.檢測劑工作液按說明書臨用前配置。
7.若標本吸光度在標準曲線測定范圍以外,應適當稀釋后重測。
[臨床意義] 在多發(fā)性硬化急性期IL-10水平處于低值,而緩解期水平則上升;SLE患者急性期IL-10 mRNA表達量明顯增高,緩解期水平則降低;類風濕關節(jié)炎及骨關節(jié)炎患者急性期IL-10水平顯著升高,緩解期水平則降低。
 


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