近年來，隨著微生物基因組學的發(fā)展，微生物基因檢測迎來了新的機遇。2000年，Makino等已經(jīng)完成V．p的基因組測序，V．p毒力基因及特異的基因序列得到進一步確定。根據(jù)V．p特異基因序列，設計引物，進行PCR檢測，是現(xiàn)階段檢測V，p的zui快速準確的方法。目前應用于檢測V．p的PCR方法主要有任意引物PCR（abritrarilyprimedPCR，Ap-PCR）、針對任意引物PCR、多重PCR（muhiplex-PCR）、實時PCR（Real-timePCR）。
1）任意引物PCR Matsumoto等采用任意引物PCR對V．p進行檢測。他們針對V。p的tdh基因和trh基因一段特異的序列，設計兩條引物，
引物1：5，--GGTGCGGGAA--3，，
引物2：5，一GTTTCGCTCC一3，，
對1977～1998年所收集的227株V．p進行PCR。通過電泳分析發(fā)現(xiàn)，1996-1998年收集的22株血清型為03：K6菌株與1996年以前收集的03：K6血清型菌株基因序列有所不同，為03；K6血清型新出現(xiàn)的變異株，并zui初出現(xiàn)在孟加拉國。這是目前zui簡單的以基因為基礎的細菌亞分型方法。
（2）針對任意引物PCR 由于臨床分離株絕大多數(shù)含有tdh基因，因此絕大部分研究者都根據(jù)tdh設計引物進行特異擴增。1993年，Lee等根據(jù)tdh基因設計引物，對36株TDH+株、89株TDH-株以及46株其他弧菌和腸道菌進行PCR檢測。結(jié)果顯示，36株TDH+株全部特異擴增出來，其余菌株都沒有擴增；而檢測靈敏度高，zui低檢測量可至40pgDNA，并可直接檢測糞便標本，無需分離培養(yǎng)，方便快速。1999年，Kim等選擇toxR基因序列設計兩對引物，
5’--GTCTTCTGACGCAATCGTTG--3和 5’一ATACGAGTGGTTGCTGTCATG一3’，
對14株V．p、14株其他弧菌進行PCR。結(jié)果顯示，14株V．p都得到一條368bp的特異擴增亮帶，而其他菌株沒有特異擴增。此外，Venkateswaran等選擇gyrB基因設計引物對V·p進行PCR、Cordova等選擇pR72H基因設計引物進行PCR，特異性、靈敏度都很好。
（3）多重PCR 由于不是全部副溶血性弧菌都含；tdh基因或，trh。基因，所以只針對tdh或trh的單一PCR，有時會漏檢。多重PCR（multiplex-PCR）能率地檢測Vpo1994年，Bej白等針對“、tdh、trh設計不同的引物對，在同一PCR反應體系內(nèi)同時擴增tl、tdh、trh。結(jié)果顯示，所有的V。p都擴增出“基因，tl基因是V．p特異的；54％的V．p擴增出tdh基因；只有38．73％的V．p擴增出trh基因；該法靈敏度高，能把log牡蠣培養(yǎng)肉湯里10～100個V．p檢測出來。與其他常規(guī)生化方法相比，多重PCR更快速，僅8h就能完成檢測，結(jié)果更為準確、可靠，而且還可改進成定量競爭PCR，對標本中靶序列進行定量。
（4）實時PCR 常規(guī)PCR檢測，需要從反應體系中吸取產(chǎn)物做電泳或Southern雜交等試驗進行鑒定，轉(zhuǎn)移過程中易污染，造成假陽性，而且耗費時間。1996年，Tyagi開創(chuàng)了一種實時PCR（Real-timePCP,）。實時PCR是在，PCR反應體系中加入標記有報告基團和淬滅基團的線性Taqman．探針或莖環(huán)型熒光分子信標探針，在墓因擴增過程中，與產(chǎn)物雜交，此時，報告基團和淬滅基團分開，根據(jù)能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，報告基團發(fā)出熒光而被檢測。這種方法操作簡單，閉管檢測，減少污染，靈敏度高，并且可以在PCR結(jié)束或PCR過程進行同步定性或定量檢測，面且可以進行臨床大規(guī)?？焖贆z測。
2003年，Blackstone等針對tdh設計熒光分子信標探針，對從牡蠣中富集的13個不同種類的菌株進行實時PCR檢測。結(jié)果顯示，只有含tdh的V．p才被檢測出來，特異性好，靈敏度高，能把每個純培養(yǎng)體系的1個CFU檢測出來。實時PCR檢測快速準確，但需要價格昂貴的熒光檢測儀和熒光分子標記探針，一般的實驗室不能廣泛開展。分子信標實時PCR技術(shù)自1996年開創(chuàng)以來短短幾年就得到蓬勃的發(fā)展，相信隨著經(jīng)濟的發(fā)展、技術(shù)的進步、實時熒光檢測儀的昔及，將會得到更為廣泛的應用。
