細(xì)菌質(zhì)體需藉由轉(zhuǎn)形 （transformation） 的技術(shù)，將的引介入細(xì)菌體中，藉由寄主細(xì)菌的系統(tǒng)?達(dá)成復(fù)制或進(jìn)?基因表現(xiàn)的目的。寄主細(xì)菌的選擇，須視質(zhì)體的種類(lèi)及實(shí)驗(yàn)的目的而定。本實(shí)驗(yàn)的目的在建構(gòu)一個(gè)表現(xiàn)質(zhì)體，使的能在大腸桿菌中大?表現(xiàn) GUS。
然而，?用大腸桿菌進(jìn)?外源基因的表現(xiàn)時(shí)，常遇到的問(wèn)題是，外源基因的產(chǎn)物會(huì)對(duì)寄主細(xì)菌造成傷害；此外，持續(xù)?斷的表現(xiàn)外源基因也會(huì)使寄主細(xì)菌生長(zhǎng)減慢或無(wú)法生長(zhǎng)。因此，必須有適當(dāng)?shù)恼{(diào)控機(jī)制?控制外源基因的表現(xiàn)。 我們所用的載體pQE31 在T5 promoter與外源基因插入地址的間，具有一段lac operon中的lacO序?，可?用lac repressor結(jié)合其上?調(diào)控T5 promoter的啟動(dòng)，只有在inducer （?如IPTG） 加入時(shí)，才會(huì)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)?，而lac repressor的?源則必須靠寄主提供。由于此質(zhì)體為multiple copies，一般大腸桿菌菌株中l(wèi)ac repressor的含??足以有效地進(jìn)?調(diào)控，縱使未加入inducer，也會(huì)有外源蛋白質(zhì)的表現(xiàn)，萬(wàn)一外源蛋白質(zhì)對(duì)寄主造成毒害，使的無(wú)法生長(zhǎng)，我們可能?表現(xiàn)質(zhì)體?無(wú)法選殖到，?無(wú)法達(dá)成我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。 我們所選用的寄主菌株JM109 所具有的 lacIq，能夠過(guò)?表現(xiàn) （overproduce） lac repressor，因此可較有效地控制T5 promoter的啟動(dòng)。 然而，?是?JM109 這一類(lèi)帶有l(wèi)acIq的菌株?發(fā)生問(wèn)題時(shí)，就必須再?換其它的寄主菌株；?如M15[pREP4]，此菌株除?染色體上的lacI基因外，還帶有能持續(xù)表現(xiàn)lacrepressor的質(zhì)體，應(yīng)可解決lac repressor ??足的問(wèn)題。
檢定載體上是否接上外?的DNA 片段，常因質(zhì)體?同而有?同方法，一般常?用外?DNA 片段的插入導(dǎo)致載體某表現(xiàn)形的喪失 （insertional inactivation） ?作為篩選的依據(jù)；或者可?用插入的DNA 上帶有宿主所缺少的表現(xiàn)型進(jìn)?篩選。?載體與插入DNA 皆無(wú)適當(dāng)?shù)暮Y選依據(jù)，則可將菌?中的質(zhì)體抽出后，以限制酶作用后進(jìn)?電泳分析。而我們實(shí)驗(yàn)中所用的質(zhì)體pQE31，并沒(méi)有簡(jiǎn)?快速篩選重組質(zhì)體的方法可用，因此需要?用GUS 的抗體進(jìn)?colony hybridization，尋找可表現(xiàn)出GUS的轉(zhuǎn)形株；或在培養(yǎng)基中加入GUS 的基質(zhì)，轉(zhuǎn)形株?可表現(xiàn)出GUS，則可將基質(zhì)分解使菌?呈現(xiàn)藍(lán)色；或以質(zhì)體快速抽取法，篩選帶有正確分子?質(zhì)體的轉(zhuǎn)形株。 三種方法?請(qǐng)練習(xí)，得到的正反應(yīng)株均必須再抽取質(zhì)體進(jìn)?限制酶分析，以進(jìn)一步確認(rèn)質(zhì)體的正確性。
會(huì)員1.png)