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公司動態(tài)

制備scFv接頭DNA

閱讀：763發(fā)布時間：2010-7-21

器材和試劑]
● PCR試劑和設(shè)備
● 1ug任何舍有scFv及（GIy4Ser）3接頭的載體
● RHuJH引物、RHuVκ引物和RHuVλ引物，10pmol/ul

[方法]
1．在0．5ml微量離心管內(nèi)配制用于擴增的主混合液。所顯示的主混合液用于VH—Vκ接頭。對于VH—Vλ接頭的主混合液，n＝29。
單個反應(yīng)主混合液/ul （n＝25）
● 水 37 925
● 10×Vent緩沖液 5．0 125
● 20×dNTPs 2．5 62．5
● Vent DNA聚合酶 0．5 12．5
2．取24支0．5ml試管，每管分別加入RHuJH引物和RHuVκ引物，各2ul。RHuJH引物和RHuVκ引物共有24種可能的結(jié)合形式。而對于VH—Vλ接頭，則用RHuVl引物替代RHuVκ引物即可，共可編為28管。如無加熱蓋，可以加入l滴輕質(zhì)礦物油覆蓋反應(yīng)液。
3．設(shè)1個陰性對照管，加入50ul主混合液。
4．每個樣本取1．0ul scFv基因模板（約1ng），加入到主混合液中。
5．取46u1主混合液分別加入到步驟2已制備的24個管內(nèi)。
6．預(yù)加熱PCR反應(yīng)格到94℃。
7．以94℃ 1分鐘、55℃ 1分鐘、72℃1分鐘的條件共循環(huán)25次，擴增接頭序列。
8．將PCR產(chǎn)物用2．0％TBE瓊脂糖膠電泳純化，切取PCR產(chǎn)物；用Geneclean抽提，并重懸DNA于50ul水中。

 


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