[器材和試劑]
● ABl 377型測(cè)序儀
● ABI的BigDye染液
● ABl 9700型PCR儀器
● ABI藍(lán)色葡聚糖/EDTA上樣緩沖液
● 3mol/L的乙酸鈉
● 95％及70％的乙醇
● 0．4pmol/ul的fUSE5“超級(jí)反向”引物，或T7“超級(jí)上游”引物
● 一臺(tái)帶Qiagen 2X 96平板轉(zhuǎn)子或同等轉(zhuǎn)子的Qiagen 4K15C型離心機(jī)
[方法]
1．將測(cè)序反應(yīng)成分混合于10ul的反應(yīng)體積中：1．5ul來(lái)自PCR擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物， 2．5ul的MilliQ純水，2．0ul濃度為0．4pmol/ul的{USE5“超級(jí)反向”引物或T7“超級(jí)上游”引物（共0．8pmol），4.0ul的Big Dye染液。
2．在以下條件下完成熱循環(huán)：94℃放置2分鐘；分別在3個(gè)溫度下進(jìn)行PCR，進(jìn)行30次循環(huán)，分別是96℃下45秒、50℃下20秒以及60℃下3分鐘；放置在4℃下直到準(zhǔn)備純化為止。
3．向10ul的測(cè)序反應(yīng)體系中加入1ul 3mol/L乙酸鈉和25ul 95％乙醇。
4．在-20℃下孵育60分鐘以沉淀產(chǎn)物。
5．在帶Qiagen 2X 96平板轉(zhuǎn)子或同等轉(zhuǎn)子的Qiagen 4K15C型離心機(jī)中，6000r/min（5788g） 離心20分鐘。
6．迅速翻轉(zhuǎn)96孔板，并將乙醇輕輕甩出。
7．用125ul的70％乙醇洗滌。
8．在帶Qiagen 2X96平板轉(zhuǎn)子或同等轉(zhuǎn)子的Qiagen 4K15C型離心機(jī)中，6000r/mln離心5分鐘。
9．迅速翻轉(zhuǎn)96孔板，并將乙醇輕輕甩出。
10．在一個(gè)96孔加熱板上干燥15分鐘。
11．將樣品懸浮于1．5ul的ABI藍(lán)色葡聚糖/EDTA上樣緩沖液中。
12．每份樣品取0．8ul上樣到一塊預(yù)制的聚丙烯酰胺測(cè)序膠上，并在ABl 377測(cè)序儀上跑3．5小時(shí)。
13．用序列分析軟件來(lái)分析數(shù)據(jù)，如SequencherTM（GeneCodesCorp）。
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