在篩選和測序后，下一步是將單克隆的結(jié)合性用以下三種形式顯示出來：首先，得自靶標(biāo)器官的、相對于無插入序列的噬菌體及其他器官和組織而數(shù)量增加的噬菌體；其次，在器官或組織的脈管系統(tǒng)上進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色時(shí)的陽性染色；第三，我們合成、注射以及分析熒光標(biāo)記的同源多肽的生物分布，以此來建立多肽在噬菌體環(huán)境之外的活性。
1 體內(nèi)和體外的結(jié)合性
根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案10．2可以快速檢測幾個(gè)單克隆在體外的結(jié)合性，接下來根據(jù)可以檢測單克隆在體內(nèi)的結(jié)合性。陽性克隆具有得自靶標(biāo)器官的、相對于無插入序列的噬菌體及其他器官、組織和細(xì)胞數(shù)量增加的噬菌體；可能在對照器官和組織中具有比在無插入序列的噬菌體中更低的本底；而且常常比噬菌體源群落表現(xiàn)得更好。
對于一個(gè)單克隆，體外結(jié)合與體內(nèi)定位之間的比較也能提供一些關(guān)于其受體分布的信息。例如，在體內(nèi)篩選中發(fā)現(xiàn)了定位于肺的GFE—1多肽，并發(fā)現(xiàn)與其他器官和組織比較時(shí)，它僅定位于體內(nèi)的肺脈管系統(tǒng)。然而，當(dāng)進(jìn)行體外試驗(yàn)時(shí)，該多肽與肺和腎的原代細(xì)胞制備液都能結(jié)合。在發(fā)現(xiàn)了此多肽的受體——膜二肽酶以后，該原因變得清晰：膜二肽酶不僅在肺脈管系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)，而且在肺和腎的實(shí)質(zhì)細(xì)胞（parenchymal cell）中也都存在；它具有一個(gè)能將體內(nèi)數(shù)據(jù)和體外數(shù)據(jù)正確起來的分布。
2 免疫組化和免疫熒光
比起在前面實(shí)驗(yàn)方案中采用的感染性檢測，免疫組化和免疫熒光的靈敏度較低，因此在我們的實(shí)驗(yàn)方案中，有可能陽性脈管系統(tǒng)有染色，而在陰性對照器官中的本底則未著色。
對于篩選中的免疫組化和免疫熒光，我們進(jìn)行了同樣的對照比較：噬菌體比噬菌體和靶標(biāo)比靶標(biāo)。在多種器官和組織中尋找無插入序列的噬菌體的存在時(shí)將產(chǎn)生一組數(shù)據(jù)。、肝臟既是噬菌體免疫組化的陽性對照也是其陰性對照，因?yàn)镵upffer細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）的著色是強(qiáng)陽性的；然而，脈管系統(tǒng)是陰性的。Kupffer細(xì)胞著色的原因是通過這些細(xì)胞從循環(huán)中消除了噬菌體。
對于針對fd和T7多克隆血清的組織學(xué)程序的陰性對照，應(yīng)該包括純化的兔血清，或用不相關(guān)的抗原對動物進(jìn)行類似免疫而得到的IgG。把這些以相同的濃度用作初級抗體。
3 結(jié)合的特異性
在用噬菌體計(jì)數(shù)、免疫組化和免疫熒光進(jìn)行觀測時(shí)，那些合成的同源多肽可能減少或消除對靶標(biāo)的結(jié)合，我們通過這一點(diǎn)的顯示確定特異性。一般將一個(gè)結(jié)合性或定位性的多肽轉(zhuǎn)入單價(jià)的T7 Selecg—1載體或使用單獨(dú)的T7 Select415-1克隆，并從lmg/m1的多肽溶液開始（大約lmmol/L）繪制抑制曲線，然后以半對數(shù)增量（half-1og increment）+0．01tumol/L逐步增加。如果使用的是單價(jià)展示多肽，那么從抑制曲線測定的IC50就是多肽的表觀Kd值。
會員1.png)