自底物噬菌體顯示技術(shù)出現(xiàn)以來，人們對此技術(shù)進(jìn)行了很多完善和修改，并應(yīng)用于實際之中。在zui后，我們將對一些類似的系統(tǒng)進(jìn)行綜述，并描述其在解決一系列科研難題中的工用。
1 底物消減文庫
這是一種改良的底物噬菌體技術(shù)，用于區(qū)別兩種不同蛋白酶的底物特異性。首先的幾輪篩選使用*種蛋白酶篩選底物文庫，將陽性底物分離出來。之后，又用第二個蛋白酶底物對此陽性底物進(jìn)行篩選，分離得到非底物序列。結(jié)果，得到的序列能夠被*個酶水解，但是不能夠被第二個蛋白酶水解。這種方法被用于區(qū)別纖溶酶原激活物t-PA和u—pA的特異性。盡管兩種蛋白酶都可以切割在P2和P1位點上的同一種GR序列，但是通過這種方法發(fā)現(xiàn)u-PA優(yōu)先切割P3位點的*，而t-PA更偏向于切割體積較大的氨基酸，如*和*。
2 肽段連接酶的底物特異性
多種底物噬菌體展示技術(shù)被用于闡明一個工程連接酶的底物特異性。一種其活性位點221位*突變成半*、225位*突變成*的枯草桿菌蛋白酶變異體，被發(fā)現(xiàn)可以將脂化的肽段連接到其他肽段或蛋白的N末端。通過將噬菌體展示的hGH前三個密碼子隨機(jī)化制備底物噬菌體文庫，讓它與枯草桿菌蛋白酶變異體在*連接的肽脂（亞氨基*—KGAAPF-甘油—F—酰氨）存在的情況下一起反應(yīng)，用抗*蛋白的瓊脂糖珠捕獲而分離連接后的底物噬菌體。這樣，文庫中那些含有連接反應(yīng)的良好親核試劑的文庫多肽就被選擇性地富集。以此方法得到的結(jié)果與使用合成底物得到的結(jié)果符合得很好，尤其是在P1，位點上。
3 蛋白激酶的底物特異性
底物噬菌體的概念也被成功地擴(kuò)展到序列特異性的蛋白磷酸化研究之中。在這些研究中，分離步驟依靠的是一個能夠分離磷酸化底物和非磷酸化底物序列的捕獲試劑。盡管有許多抗磷酸化肽段抗體存在，必須小心地確保捕獲步驟中僅涉及識別磷酸化的氨基酸，而捕獲集團(tuán)本身不會對序列產(chǎn)生任何的偏好。這種底物噬菌體文庫的“捕獲的編輯”使分離磷酸化*和磷酸化*殘基，要比分離更大的磷酸化*更加困難。至少有一篇用噬菌體文庫對包含磷酸化*和磷酸化*殘基的底物進(jìn)行篩選的報道[2叼。然而，在這個例子中，捕獲抗體僅特異性識別細(xì)胞分裂期（M期）的磷酸化蛋白，因此僅能篩選出同時帶有此抗體表位的激酶底物。
現(xiàn)在已經(jīng)有部分蛋白*激酶用此方法進(jìn)行研究，包括c-Src、Blk、Lyn、Syk以及Fyn?？梢允褂脙煞N不同的噬菌體展示系統(tǒng)：一種是利用底物文庫與全長的基因Ⅲ融合的單價展示系統(tǒng)，另一種是將底物文庫與基因Ⅷ融合的多價展示系統(tǒng)。像在蛋白酶底物展示中一樣，必須進(jìn)行預(yù)實驗以優(yōu)化篩選條件，并證實可以通過此方法特異性地富集陽性底物序列。在肽段磷酸化酶的篩選中，理論上噬菌體的包膜蛋白能夠與底物文庫一樣被激酶修飾，使得特異性篩選更加困難。另外，如果激酶含有磷酸化肽段結(jié)合性區(qū)域（如SH2）能夠與磷酸化的噬菌體肽段相互作用而篩選出非特異性的底物，那么使用多價展示系統(tǒng)篩選底物可能會使問題變得更加復(fù)雜[22）。然而，小心地對待這些問題，底物噬菌體展示技術(shù)可以成功地應(yīng)用于確定密切相關(guān)的兩種蛋白*激酶的不同特異性。
4 用反轉(zhuǎn)錄病毒展示載體（retroviral display vector）進(jìn)行的體內(nèi)篩選
Buchholz等人使用另一種替代方法即利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體展示底物文庫，從而使得底物篩選的過程能夠在完整的哺乳動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。在這種篩選過程中，表皮生長因子（EGF）與病毒的一個包膜蛋白融合，因而使得病毒的感染性在富含EGF受體的細(xì)胞中大大降低，而在酶切作用下釋放EGF使得病毒恢復(fù)了感染活性。通過在EGF和包膜蛋白之間插入隨機(jī)的底物序列，測定切割/感染活性，作者得以證實那些具有細(xì)胞蛋白酶的弗林蛋白酶/激素原轉(zhuǎn)化酶（furin/prohormoneconvertase）家族共有酶切位點的底物的富集。
自出現(xiàn)開始，底物噬菌體展示技術(shù)就顯示了其在探測底物活性中強(qiáng)大的作用。許多不同的實驗室構(gòu)建了一系列底物噬菌體展示載體，并用于測定許多酶（主要為蛋白酶和蛋白激酶）的底物序列。然而其應(yīng)用前景比這些還廣闊得多；很多肽段轉(zhuǎn)錄后的修飾也能應(yīng)用于底物噬菌體展示的方法。zui后，幾個的應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)的新方法正在開始出現(xiàn)。這其中包括在更廣意義上的探測酶與底物間相互作用的方法，在這種情況下，酶與底物都被展示于同一個噬菌體顆粒上。
