在一個底物噬菌體展示實(shí)驗的準(zhǔn)備過程中，*步就是要確定用于文庫展示的載體以及如何構(gòu)建后繼的底物文庫。單價和多價的pⅢ蛋白噬菌體展示體系都可用于底物噬菌體展示。如果采用的是單價展示體系，只有一部分噬菌體顆粒的表面攜帶有單一的底物序列與親和性結(jié)構(gòu)域。這意味著在篩選之前，必須先通過親和性結(jié)構(gòu)域?qū)⑹删w固定在一個固體支持物上。理論上，多價底物噬菌體展示顆粒都包含有超過一個拷貝的親和性結(jié)構(gòu)域和底物，要篩選出某一噬菌體顆粒時，蛋白酶必須對此噬菌體顆粒攜帶的多個底物都進(jìn)行切割。假設(shè)所有的多價噬菌體衣殼蛋白上都同時表達(dá)有底物蛋白，那么篩選可以同后續(xù)的捕獲親和性結(jié)構(gòu)域這一過程同時在溶液中進(jìn)行。這使得實(shí)驗具有可檢測性；然而，有效的篩選要保證所有未剪切的噬菌體都能通過捕獲與之共表達(dá)的親和性結(jié)構(gòu)域而去除。在實(shí)際操作中，一些攜帶有缺陷型表位的沒有反應(yīng)活性（即不能被剪切）的噬菌體克隆可能在此過程中被當(dāng)作合適的底物篩選出來。同樣的，一群給定的多價噬菌體中也可能包括有許多正在降解中的噬菌體，因此，單個病毒顆粒的效價可能有所變化。同時，多價的噬菌體展示體系也需要一個全長的、未剪切過的pⅢ蛋白來實(shí)現(xiàn)感染。如果經(jīng)過剪切的噬菌體比未剪切的噬菌體有更高的感染活性，那么這一條件可以作為選擇性的優(yōu)勢來篩選出酶的真正底物。然而，即使在沒有蛋白酶切割的情況下，文庫中的某些序列也可能具有較高的感染活性，因而使得初始的文庫分布和隨后的篩選過程帶有偏差。
盡管存在以上的限制，單價和多價的噬菌體展示系統(tǒng)都已被成功地應(yīng)用于確定許多蛋白酶的底物。在這一章中，我們將把注意力集中在pⅢ噬菌粒/單價展示系統(tǒng)，盡管這種單價展示系統(tǒng)中的許多特點(diǎn)和多價展示系統(tǒng)一致。底物噬菌粒展示中zui典型的一個載體，具有以下幾個重要的特征：
①由親和性結(jié)構(gòu)域基因、編碼底物序列和M13基因Ⅲ三個部分組成的融合蛋白基因；
②用于大腸桿菌中融合蛋白組成性表達(dá)的啟動子序列；
③細(xì)菌及f1復(fù)制起始位點(diǎn)，加上一個抗生素抗性基因。
在第1章和第4章中可以找到更多關(guān)于噬菌體展示載體的細(xì)節(jié)描述。這里，我們將注意力集中于底物噬菌體展示應(yīng)用相關(guān)的載體設(shè)計。
1 相互結(jié)合位點(diǎn)的選擇
在蛋白酶底物噬菌體展示中，一個關(guān)鍵的組分是親和性結(jié)構(gòu)域，它使我們可以將底物序列和非底物序列區(qū)分開。這其中包括蛋白—蛋白相互作用、蛋白—肽段相互作用以及多*與鎳螯合基質(zhì)的結(jié)合。整合這幾種不同的系統(tǒng)的要素在于，展示系統(tǒng)是基于高親和性相互作用而設(shè)計的。通常，相互結(jié)合的兩個物質(zhì)之間的解離常數(shù)（Kd）應(yīng)該至少在一個較低的nmol/L的數(shù)量級上，這樣在實(shí)驗中復(fù)合物的解離速度就可以比蛋白酶解的速度慢得多。例如，我們以往在這個領(lǐng)域中的工作中，利用的是一個hGH的高親和性變異體，此變異體與其受體的Kd值約13pmol/L。然而，對于蛋白酶底物噬菌體展示庫，挑選在適當(dāng)?shù)木彌_液條件下（例如低pH或高pH）能夠被破壞的這種相互作用，將有助于選擇性地富集非底物序列（被捕獲而結(jié)合于固體支持物上）和*的底物序列（被蛋白酶解而釋放）。另外一個必須考慮的是靶蛋白酶（或者其他的一些噬菌粒形成中可能碰到的蛋白酶）必須不會酶切親和性結(jié)構(gòu)域。由于這個原因，親和性結(jié)構(gòu)域一般都是一個穩(wěn)定的球蛋白或者一個短的肽段。
2 底物卡匣（cassette）的設(shè)計和構(gòu)建
底物噬菌體展示要成功，一個關(guān)鍵在于切割僅僅發(fā)生在親和性（捕獲）結(jié)構(gòu)域和噬菌粒之間。幸運(yùn)的是，絲狀噬菌體對蛋白酶解有*的抗性：在所有已知的蛋白酶中，只有枯草桿菌蛋白酶能夠引起噬菌體外膜蛋白的顯著降解。為使底物序列更易與蛋白酶作用，在附近的連接序列中引入一定部分柔韌性（segmental flexibility）的設(shè)計要謹(jǐn)慎。例如，底物序列GPGG（X）。GGPG位于親和性結(jié)構(gòu)域和pⅢ基因之間，柔韌的*—*接頭分布于隨機(jī)序列的兩端。在我們的實(shí)驗中，已經(jīng)證實(shí)截短形式的pⅢ蛋白是有效的，但另外也有報道使用全長pⅢ蛋白也能取得成功。在多價底物噬菌體展示中，一個全長pⅢ蛋白對于感染是必需的。
一些其他的重要因素也主導(dǎo)著文庫卡匣的設(shè)計，包括隨機(jī)化的密碼子、密碼子的選擇以及文庫的大小，這些在第2章中有詳細(xì)的描述。在許多情況下，我們不可能窮盡含有8個或8個以上的殘基的整個底物序列所有可能的排列。然而，在文庫僅展示了一部分可得到的序列的情況下，我們也有可能得到關(guān)于底物特異性的相關(guān)信息。例如，要構(gòu)建一個包含5個密碼子的隨機(jī)文庫，可以先列舉其中2個密碼子的序列，以此作為參照序列；從中得到的信息可用于第二次的文庫構(gòu)建，即將此兩個密碼子固定，再列舉另外3個密碼子和（或）其他的擴(kuò)展的底物序列。作為替代，可以通過整合已知的特異性決定因素并查明那些現(xiàn)在還較不清楚的因素，從頭設(shè)計一個更集中的文庫。
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