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公司動(dòng)態(tài)

固定化的包被試劑和加入的噬菌體的滴定

閱讀：469發(fā)布時(shí)間：2010-8-17

[器材和試劑]
● 塑料加樣槽（reagent reservoir Costar）
● 96孔板（“非黏性”的Nunc F型微孔板，或者聚丙烯微孔板）
● HRP聯(lián)結(jié)的抗M13抗體（Stratagene）
● TMB底物試劑盒（Pierce）
● 2mol/L硫酸溶液
● CBB
● 微型振蕩器（Bellco）
● 酶標(biāo)儀
 

[方法]
1．如實(shí)驗(yàn)方案5．1所述，將靶標(biāo)蛋白進(jìn)行兩倍梯度稀釋（例如16ug/m1、8ug/m1、4ug/ ml、2ug/ml、1ug/ml、0．5ug/m1、0．25ug/ml）后包被Maxisorp微孔板。A排中加 入zui高的濃度，從B排到G排濃度依次降低。A排不要加入靶標(biāo)溶液，以作為對(duì)照來(lái)測(cè)定噬菌體非特異性的結(jié)合。
2．在單獨(dú)的一個(gè)非黏性微孔板中，將噬菌體在CBB中進(jìn)行兩倍梯度稀釋，使得第1道中 噬菌體濃度zui高，第2道至第12道濃度依次降低。
3．倒出并控干步驟l中包被過(guò)的微孔板中的洗滌緩沖液，將100ul稀釋后的噬菌體溶液直 接加入固定了靶標(biāo)的微孔板。
4．將微孔板蓋好，在室溫下放置60分鐘。
5．吸去微孔板內(nèi)溶液，洗滌12次。
6．加入用CBB稀釋2000倍后HRP聯(lián)結(jié)的抗M13抗體，每孔100ul，在室溫下反應(yīng)20分鐘。吸去板內(nèi)液體，洗滌8次，倒出并控干洗滌緩沖液。
7．加入100/11 TMB顯色液（預(yù)先在室溫下平衡），在微型振蕩器上避光充分振蕩10分鐘。
8．立即加入100ul 2mol/L的硫酸溶液終止顯色反應(yīng)，充分振蕩30秒后用酶標(biāo)儀讀取4SOnm處（A450）的吸光度值。

 


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