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上海酶聯(lián)生物研究所
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：340發(fā)布時間：2011-9-15
RT-PCR已經用于蚊子和臨床樣品中RVFV的檢測。Sall等用RT-PCR對NS（S）蛋白編碼區(qū)進行序列分析，用于系統(tǒng)發(fā)育分析以鑒定病毒的兩個不同譜系，發(fā)現(xiàn)一個是埃及的，另一個是撒哈拉的，使得RT-PCR成為分子流行病學的有力工具。
Ibrahim等從M節(jié)段的高度保守的區(qū)域設計了兩對PCR引物用于RT-PCR和巢式RT—PCR，所擴增的序列為G2糖蛋白基因的一部分。由于在GenBank中只能查到ZH—501和ZH—548M12毒株M節(jié)段的全序列，但是可以得到其他24株毒株的部分核苷酸序列；當這些從26個不同的毒株中已知的核苷酸被比對時，從90—1711bp重疊部分有95．5％一100％的同源性，表明這一區(qū)域在RVFV里面是高度保守的。Battles等也已表明這一區(qū)域在來自不同宿主的6個非洲國家超過34年的收集到的22分離株間是高度保守的。盡管在這項研究中使用的引物只在一株裂谷熱病毒中被測試，Ibrahim等預言這些引物如果不是全部但也可
能擴增大部分RFV病毒株，因為這些引物是在高度保守的區(qū)域內選取的。另一方面，這些引物同非裂谷熱的其他白蛉熱病毒序列的同源性較低，暗示了同其他白蛉熱病毒應該沒有交叉反應性。
Sall等在RVFV的S節(jié)段設計了保守的寡核苷酸引物，建立了一管巢式RT-PCR方法，當RVRV人為地用人正常血清進行系列稀釋時，使用簡單的RT-PCR和巢式RT-PCR分別可以檢測到zui小50個PFU和0．5個PFU。RT-PCR方法對于檢測試驗感染的小鼠和駱駝的血中的裂谷熱病毒RNA是有效的，并且發(fā)現(xiàn)巢式RT-PCR比病毒分離方法更為靈敏。這一方法被成功地運用于1998年毛里塔尼亞暴發(fā)時人的病例的檢測。同時作者指出，血清學方法（1sM和IgG捕獲ELISA）在用于病毒感染晚期收集的樣品的檢測時是適當的；而應用早期樣品進行診斷時，RT-PCR或者病毒分離是應當的。當此方法同IgG抗體檢測相結合時，與病毒分離（Ⅵ）方法的符合率可以達到100％，可以與IgG檢測結合被作為RFV早期疑似病例的常規(guī)檢測方法。
Espach等也建立了一管法RT-PCR方法檢測早期血清或者血液樣品中的RVFV，擴增序列位于病毒的M節(jié)段的糖蛋白基因，檢測靈敏度比Sail等所建立的巢式RT-PCR方法高，可以達到0．25 TCID5。，相當于0．17PFU。
非常值得注意的是試驗的靈敏度依賴于幾個因素，如樣品來源、核酸提取方法、RT—PCR擴增和熱循環(huán)條件等，在不同的實驗室使用的條件可能都需要優(yōu)化。例如從蚊子中提取裂谷熱病毒RNA的方法，盡管可能在25只或50只感染的蚊子當中檢測一個感染的蚊子（只有當RNA樣品用酚：三氯甲烷重新提取，并且用異丙醇重沉淀時），使用10只或者更少的蚊子群體避免了RT-PCR抑制劑，但是如果使用更多的蚊子樣品，可能需要增加酚；三氯甲烷或改變RNA提取程序。
Real-timePCR方法 Garcia等首先運用Real—time PCR中的TaqMan技術建立了檢測RVFV的方法，目的片段位于NSs區(qū)域。使用從含有目的基因的質粒體外轉錄合成的RNA建立了標準曲線，Real-timeRT-PCR用從感染的Vero細胞得來的RVFV進行了評估，發(fā)現(xiàn)這一方法對RVFV是特異的，并且被成功地運用于感染了RVFV的動物血清樣品中病毒基因組的檢測，靈敏度為可以檢測到50—100個拷貝（用人工合成的RNA進行評估）和10 TCIDs。每毫升的病毒量；并且運用此方法評估了抗病毒藥物的抗病毒效果。另外，Drosten等也建立了能夠鑒別病毒性出血熱相似癥狀的幾種不同病毒的Real-timePCR方法，其中包括使用Taq—Man技術檢測RVFV，所設計的目的擴增片段位于G2基因。Real-timePCR作為一項RVF早期確診和隨后的抗病毒治療評價的常規(guī)檢測方法將十分有用。
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