細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)若干問題與注意事項(xiàng)、解決方案
一、 細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)問答
1.BHK細(xì)胞就是指BHK21嗎？
答：BHK細(xì)胞是指幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞（Baby Hamster Syrian Kidney），1961年建株。原始的細(xì)胞株是成纖維細(xì)胞，貼壁依賴性。1963年獲得單細(xì)胞克隆細(xì)胞。后經(jīng)無數(shù)次傳代后細(xì)胞可懸浮生長(zhǎng)，它廣泛用于增殖各種病毒，生產(chǎn)獸用疫苗。 zui常用的是BHK21的一個(gè)亞克隆細(xì)胞，即克隆13或C13 。
2.二倍體細(xì)胞有什么特點(diǎn)？
答：二倍體細(xì)胞的染色體組型是2n核型；貼壁依賴接觸抑制；一般可傳代50代；無致瘤性。如W1-38：正常胚肺組織*系。MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的*系
。
3.什么是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)？
答：所謂動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scale culture technology）是指在人工條件下（設(shè)定pH、溫度、溶氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞及*、CHO（中華倉(cāng)鼠卵巢）細(xì)胞、BHK-21、Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎傳代細(xì)胞）等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細(xì)胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。
在過去幾十年來，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)有了很大發(fā)展，從使用轉(zhuǎn)瓶（roller bottle） 、CellCube等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)展為生物反應(yīng)器（Bioreactor）進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。
4.細(xì)胞體內(nèi)外培養(yǎng)的差別是什么？
答：細(xì)胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡相對(duì)穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長(zhǎng)，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無限生長(zhǎng)的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實(shí)際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開始發(fā)生了。
5.什么是無血清培養(yǎng)基？與普通培養(yǎng)基有什么區(qū)別？
答：無血清培養(yǎng)基（serum free medium,SFM）:是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。添加組分可能包括纖連蛋白、層粘連蛋白等貼壁因子、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒等。
6.什么是無血清無動(dòng)物組分培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基？
答：無血清無動(dòng)物組分培養(yǎng)基是不含任何動(dòng)物來源成份的無血清培養(yǎng)基，但可能添加植物蛋白或重組蛋白。無蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）:即不含有蛋白的培養(yǎng)基，無論是植物蛋白或動(dòng)物蛋白。成分培養(yǎng)基（chemical defined medium,CDM）:是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有蛋白，也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物和產(chǎn)品純化。
7.HEPES在細(xì)胞培養(yǎng)過程中起什么作用？
答：HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。
8.CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？
答：定期（至少每?jī)芍芤淮危?以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
二、 培養(yǎng)基生產(chǎn)和使用常見問題
1. 低血清培養(yǎng)基能用肉眼判斷其pH值嗎？
答：低血清培養(yǎng)基中酚紅的含量與普通培養(yǎng)基中的酚紅含量不同，不能通過肉眼觀察或通過經(jīng)驗(yàn)來判定pH值，建議使用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。
2.低血清培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)是什么？
答：平衡鹽一般是由無機(jī)鹽及葡萄糖組成的。平衡鹽有Hanks′系統(tǒng)、Earle′s系統(tǒng)、Dulbecco′s磷酸緩沖鹽系統(tǒng)等。199系列培養(yǎng)基、MEM系列培養(yǎng)基均有Hanks′系統(tǒng)的培養(yǎng)基及Earle′s系統(tǒng)的培養(yǎng)基。但是有些培養(yǎng)基均不是以上常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，例如RPMI 1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基。MEM（SLM）低血清培養(yǎng)基的平衡鹽系統(tǒng)也不是常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，該平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力強(qiáng)于常規(guī)平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力。
3.*溶液和*的配制方法是什么？
答：以0.2mol/L的 L-*配制為例：稱取L-*2.92g，加注射用水100ml，充分?jǐn)嚢杌靹颉Ｓ?.2μm濾膜正壓過濾除菌。溶液應(yīng)在4℃下避光保存，2周內(nèi)使用。 以7.5% NaHCO3的配制為例：稱取NaHCO37.5g溶于100ml蒸餾水中過濾除菌。
4.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
答：酚紅在培養(yǎng)基中用作pH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。酚紅本身對(duì)生物制品質(zhì)量并不會(huì)產(chǎn)生影響，可以通過純化技術(shù)去除，但酚紅在無血清培養(yǎng)基可能帶來胞內(nèi)鈉/鉀失衡，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)然這種作用能被血清所中和或減輕。 酚紅并不是培養(yǎng)基中必需的一種成分，很多國(guó)外的疫苗或抗體生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中都使用無酚紅培養(yǎng)基。
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