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上海酶聯(lián)生物研究所
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閱讀：761發(fā)布時間：2011-09-23
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實踐出真知，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的金丹總結(jié)了多個細胞的消化經(jīng)驗，對*消化方法進行了改進。
背景：對于絕大多數(shù)實驗室培養(yǎng)的用作模型的細胞來說，細胞傳代是一項*的工作，常用的傳代方法為：向長滿了細胞的培養(yǎng)瓶中加入足量*浸泡消化細胞一段時間后再分散細胞并傳代。但是各種細胞對*的敏感度千差萬別，有的細胞比如HEK293系列的極容易消化，而有些如RAW264.7幾乎不能被*從瓶壁上消化下來。消化時間不夠，后續(xù)的細胞分散就需要用機械力，這樣對細胞損傷太大，而且往往達不到很好的效果；消化過度，則會引起某些敏感的細胞的死亡，對于廣大新手來說，在培養(yǎng)細胞時*的消化程度很難把握。
方法改進：
1. *消化：細胞長滿后，棄培養(yǎng)基，用無菌PBS或者0.25%的*溶液適量浸洗細胞一次，浸洗的目的是去除生活藏培養(yǎng)基中的血清等抑制*活性的物質(zhì)，洗完后棄凈洗液，再次用0.25%的*溶液潤洗一次，洗完后小心丟棄洗液，此時瓶內(nèi)還會殘留很少的*溶液，蓋好細胞瓶塞，放入培養(yǎng)箱進行消化直到對光可見明顯的細胞間隙增大，瓶內(nèi)變圓細胞開始整體脫落，此時加入生長培養(yǎng)基終止消化，后續(xù)輕微用移液器吹打即可很好的分散細胞。
2. 有些實驗室采用添加EDTA的方法增加*的消化能力，但是添加的EDTA會大量螯合體系中的二價離子，如Ca2+，如此會導(dǎo)致細胞尤為環(huán)境及胞內(nèi)離子的大量流失，容易對細胞照成更大的損傷。因此，本人改進的方法中不使用添加EDTA的*消化液。
3. 對于本身貼壁不牢但是又容易聚集生長的細胞，典型的例子就是HEK293,方法可以改進為：采用上述殘液消化，但是在放入37度培養(yǎng)箱消化時培養(yǎng)瓶倒置，適當(dāng)延長消化時間（HEK293:5-8min）；因為無論是直接倒出還是用吸管吸，培養(yǎng)瓶內(nèi)殘留的*還是很多，這類細胞極易從瓶壁上大塊脫落后，在*溶液里面形成團狀，極難被消化分散。
4. 對RAW264.7這類極難用*消化的細胞，可采用的改進方法如下：第二次用*浸洗時延長時間至5-10min，之后倒出*，剩余殘液繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中進行消化10-15min，此時細胞可很容易的被吹打分散均勻。
結(jié)果：本實驗室培養(yǎng)了COS7,HEK293,NIH3T3,HepG2,RAW264.7以及原代細胞等多種生長特性的細胞，從貼壁不牢固的COS7,HEK293等細胞到一般用細胞刮刀傳代的RAW264.7,現(xiàn)在基本都采用這種傳代方法，在傳代培養(yǎng)是可以獲得很好的單細胞懸液，對細胞的損害也比以前的方法（浸泡消化，添加EDTA）小很多，細胞生長狀態(tài)良好。
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