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上海酶聯(lián)生物研究所
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閱讀：687發(fā)布時間：2010-05-31
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如何地轉染胚胎干細胞？
Bio-Rad公司近日在其上發(fā)布了一篇技術指南，是由美國得克薩斯大學健康科學中心的Eva Zsigmond撰寫的，講述的是如何利用Gene Pulser Mxcell電穿孔系統(tǒng)轉染小鼠和人的胚胎干細胞。
此技術指南（編號為5904）研究了電穿孔參數(shù)的優(yōu)化，以更地將DNA導入小鼠胚胎干細胞和人胚胎干細胞，這些細胞是在克隆形成和無滋養(yǎng)層的條件下生長的。
電穿孔是將基因導入小鼠胚胎干細胞的理想方法。使用已經確立的電穿孔參數(shù)，小鼠ES細胞能夠率地穩(wěn)定轉染，在多能性和核型穩(wěn)定性方面沒有不良影響。然而，與小鼠胚胎干細胞相比，人胚胎干細胞在電穿孔后存活率和轉染效率都要低一些。
目前關于電穿孔人胚胎干細胞的文獻不多，且大部分方法都是針對特定的細胞系或基因座，很難推廣到所有干細胞。于是，Zsigmond的研究小組想要優(yōu)化電穿孔參數(shù)，將DNA導入無滋養(yǎng)層條件下的ES細胞。
與其它系統(tǒng)相比，Bio-Rad的Gene Pulser Mxcell電穿孔系統(tǒng)的主要優(yōu)勢在于除了目前的程序，每個關鍵參數(shù)都是可編程的，從電壓到脈沖次數(shù)，讓研究人員能夠找到特定細胞的條件，包括難轉染的原代細胞和干細胞。此外，該系統(tǒng)是96孔板形式，能篩選不同的電穿孔條件。
Gene Pulser Mxcell電穿孔系統(tǒng)采用開放的架構，允許Zsigmond的研究小組確定小鼠及人胚胎干細胞轉染的*步驟，同時優(yōu)化細胞存活率。研究人員保持DNA濃度恒定，細胞密度相近，采用不同的電壓（250 V和300 V）以及不同的電容參數(shù)（100 μF、200 μF、300 μF和950 μF）來檢測轉染效率和存活率。
研究表明，電容在200 μF時，細胞存活率和GFP表達都為zui有利的水平，而低電壓（250 V）時的存活率略高于高電壓。研究人員鑒定出人ES細胞的*電穿孔條件為電壓250 V，電容 200 μF，電阻 1000 Ω及指數(shù)波形。不過這些結果還需要進一步的驗證。
研究人員認為電穿孔是將DNA導入細胞的簡單且有效的方法，且實驗中針對無滋養(yǎng)層的ES細胞的電穿孔條件可能對未來的臨床應用很重要。
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