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自動生化分析儀基本參數(shù)及應用

閱讀：476發(fā)布時間：2011-11-7

 

了解生化分析儀基本參數(shù)的原理，有利于儀器、試劑的正確使用，有助于正確分析和處理測定數(shù)據(jù)。但是，配套系統(tǒng)的原裝分析參數(shù)不宜更改；采用非儀器配套的試劑及校準品體系時，參數(shù)修改要慎重，對于不同儀器、不同類型的反應分析程序，所顯示的人機對話分析參數(shù)信息有所不同。

一、反應監(jiān)測時間

對于終點法來說，讀取反應達到平衡時的吸光度計算樣品中待測物的濃度。對于連續(xù)監(jiān)測法來說，要注意觀察反應進程曲線，從而確定反應的預孵育期，延遲時間、連續(xù)監(jiān)測的時段。對于一級或偽一級反應來說，連續(xù)監(jiān)測的時間是一級反應的動態(tài)期的吸光度；對于基于零級反應的酶催化活性濃度速率法測定，連續(xù)監(jiān)測的是零級線性反應期的吸光度。對于連續(xù)監(jiān)測法來說，動態(tài)反應期的時間越長，越適用于臨床應用，對于以酶為工具的代謝物酶促動力測定法，要增加動態(tài)反應期，即延長反應達到平衡的時間，可在反應體系中加入競爭性抑制劑，這樣還可以提高測定的線性范圍，對于酶催化活性濃度連續(xù)監(jiān)測法來說，一定要注意線性反應時間，有的酶，例如，以硫代丁酰*為底物的血清假性*酯酶速率測定法，線性反應時間只有90秒。對于連續(xù)監(jiān)測法來說，在監(jiān)測期至少應讀4個點（3個△A）。

多數(shù)*可以在整個測定反應周期連續(xù)監(jiān)測（如HITACHI 7170常規(guī)測定周期10分鐘、監(jiān)測34點，OLYMPUS AU 600固定周期8分15秒、監(jiān)測27點），但反應監(jiān)測時間是指該時間內(nèi)的測定讀數(shù)要用于結(jié)果計算。它的設(shè)置與加樣點、加試劑點（包括R1、R2……）、監(jiān)測時間（讀數(shù)點）、讀數(shù)間隔時間及試劑樣品比例等有關(guān)，要結(jié)合方法學，兼顧權(quán)衡。

1．反應時間（Reaction Time） 指儀器的一個分析周期中，試劑和樣品混合zui末一點測定讀數(shù)時間。它對終點法尤其重要，是終點法的瓶頸。有的儀器多個反應時間可選L如Hl—TACHI 7170），須預先選定。多數(shù)儀器10分鐘左右，這對試劑提出了較高要求。不少終點法試劑（尤其手工法試劑）反應時間常常也在lO分鐘上下，測定時間沒有余地，當樣品濃度高或試劑質(zhì)量下降時，均可致測定結(jié)果偏低。因此，終點法不宜采用標明反應時間接近和長于儀器zui大反應時間的試劑盒。否則，必須用接近測定范圍上限的高濃度質(zhì)控血清監(jiān)測。

2．監(jiān)測時間（讀數(shù)點）和讀數(shù)間隔時間各類型儀器不盡一致。離心式生化儀讀數(shù)間隔時間短，監(jiān)測時間也短。流動式生化儀讀數(shù)間隔時間一般較長。分立式生化儀一般監(jiān)測時間10分鐘左右，間隔10-30秒讀數(shù)一次。有的儀器在整個測定反應周期全程讀數(shù)，有的只讀取時間（點）的吸光度。

3．加試劑點采用雙試劑時，加R2點決定R1與樣品的反應時間，也決定R2與R1及樣品的反應時間。一般儀器各5分鐘左右。HITACHI 7170有4個加試劑點，若采用雙試劑，各5分鐘，則加R2設(shè)在第3加試劑點。

4．反應監(jiān)測時間還要考慮延遲時間的長短、測定物質(zhì)的濃度范圍及相關(guān)臨床價值和工作效率等因素。

二、延遲時間

延遲時間（Delay Time）指試劑與樣品混合后到監(jiān)測開始之間的時間。一般用于兩點法和速率法，某些情況下也用于終點法。終點法應選擇反應趨于平衡的時間（穩(wěn)定期或平衡期）作測定，測定點前即所謂的孵育期。速率法的線性反應期之前即延遲期。正確選擇延遲時間的長短，有利于準確測定，減少試驗誤差。設(shè)置一般根據(jù)試劑盒的說明書，還應考慮本室的儀器特點和工作程序。

1．儀器特點 比如，半自動生化儀多為流動比色池，要考慮泵速、進樣管長短、反應液黏稠度及混合情況，以及室溫、反應液溫度同反應要求溫度間的溫差等。全自動生化儀的測定讀數(shù)設(shè)置方式不同，直接以“秒”設(shè)置，或以測定點設(shè)置、測定點間隔時間不一樣，需要靈活掌握。

2．試劑及方法學

（1）試劑組成在酶活性的連續(xù)監(jiān)測法時，若試劑含工具酶數(shù)量多、偶聯(lián)反應多，則激活反應時間一般較長，延遲時間也較長，如肌酸激酶（NAC法）延遲時間常設(shè)置120-180秒；若試劑中底物經(jīng)待測酶催化，其產(chǎn)物可以直接測定的，則延遲時間較短，如 -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）設(shè)定30-60秒。同一項目同一方法，但試劑配方不同，其反應快慢等特征也可能不同，如白蛋白測定。白蛋白與溴甲酚綠（BCG）為即時反應，10秒鐘內(nèi)已完成，其后球蛋白等也將與BCG發(fā)生反應，所以孵育時間不能延長。但在同一測定時間，BcG濃度、緩沖液種類、pH和表面活性劑不J司的試劑，測定結(jié)果可能差異明顯。

（2）樣品異常成分干擾有的試驗項目需要用工具酶將內(nèi)源性代謝產(chǎn)物耗盡，比如*氨基轉(zhuǎn)移酶活性測定試劑中須有足量的乳酸脫氫酶（LDH）。如果使用單試劑，正常血清樣品延遲時間60秒即可；但當內(nèi)源性酮酸增多（如酮癥酸中毒）時，試劑內(nèi)LDH常常不能在60秒內(nèi)*將其清除，剩余酮酸會進入監(jiān)測期干擾測定，使測定結(jié)果偏高，所以延遲時間應增至90～120秒。采用雙試劑，則可在加入R1后即進入預孵育期。

（3）方法學要求比如肌酐（Jaffe法）測定的特異性不強，一般認為反應前20秒左右為乙酰乙酸等快反應干擾物呈色，后約80～100秒為蛋白質(zhì)等慢反應假肌酐呈色，20~60秒肌酐呈色反應占主導地位。采用兩點法或速率法可減少干擾，但具體取多長的延遲時間，應根據(jù)試劑和儀器讀數(shù)特點，以干擾試驗等方法來評價決定。

3.工作程序 要在保證準確性的前提下，合理設(shè)置參數(shù)，提高工作效率。zui突出的例子是半自動生化儀上酶活性連續(xù)監(jiān)測法的延遲時間設(shè)定。由于只能單份樣品逐一測定，若延遲時問全部設(shè)置在儀器內(nèi)，每個延遲時間加監(jiān)測時間至少1分鐘以上，守候時間較長。工作量大時，可以根據(jù)儀器控溫、加樣及讀數(shù)和試劑特點，以及室溫情況，將延遲時問挪一部分到機外，套式操作，但要確保機內(nèi)延遲時間不要進入線性反應期。

4．要兼顧延遲時間和監(jiān)測時間反應時間是有限制的。在速率法和兩點法中，延長延遲時間必然縮短線性監(jiān)測期，減少測定的線性范圍，也易發(fā)生底物耗盡。

三、樣品量、試劑量與稀釋量

有關(guān)參數(shù)包括樣品量、試劑量、稀釋水量、zui小反應體積和zui大比色杯容量等。如HITACHI7170反應體積180~380µl，zui大體積570µ l。BT 224半自動生化儀流動比色池容積33µl，吸液量200～990µl，zui適體積500µl。

1．zui小反應體積 在儀器光度讀數(shù)要用于結(jié)果計算時，反應液液面高度不低于光度計光徑的zui小體積。它保證儀器的正確讀數(shù)和計算，也是儀器測定精度和經(jīng)濟性的指針之一。在有的儀器中，它以反應體積的下限表示，有的則專門標明zui小反應體積。在單試劑測定中，樣品與試劑的總體積不得少于此參數(shù)。在雙試劑測定中，若R1與樣品的反應讀數(shù)不納入結(jié)果計算。R1自勺加液量可不考慮此參數(shù)，如連續(xù)監(jiān)測法；否則應考慮它對結(jié)果的影響，如終點法在加R2之前讀數(shù)，并以此來扣除試劑或樣品空白時。

在半自動生化儀中，zui適吸人量相當于zui少反應體積。它與進液管道長度、流動比色池容積，吸液泵抽吸力大小和液體黏稠度有關(guān)，它要保證光度檢測不受空泡和前后樣品攜帶污染的干擾。因此，吸人體積不能任意降低，必要時，應加大反應液量和吸人量。

2．zui大比色杯容量 這個參數(shù)含義明確。在有的儀器中，它以反應體積的上限表示，有的則專門標明zui大比色杯容量。反應液超過此體積，將致液體外溢，儀器測定系統(tǒng)被污損。

3．樣品試劑比例樣品與試劑的比例（SV：RV），也可表示為樣品體積分數(shù)——樣品體積與反應液總體積的比值（SV／TV），是方法學基本參數(shù)。酶活力測定中，樣品在總體積中的比例應在10％以下。一般來說，待測物質(zhì)在樣品中含量低的、生理波動范圍大的，樣品用量較大。如Trinder反應測定血清葡萄糖、*等，樣品試劑比例多為1：1OO，測定血尿酸或高密度脂蛋白*，常增加為1：50；ALT和AST的樣品試劑比例多為1：1O至1：20。方法靈敏、吸光度高的實驗方法，樣品試劑比例小,如白蛋白BCG法，樣品試劑比例常為1：200。肌酐Jaffe氏法監(jiān)測時間短、吸光度值較低，樣品試劑比例多為1：10。一般應以試劑說明為準，不宜輕易改動。

（1）改動樣品試劑比例，影響一系列方法學參數(shù)。若比例增大，則線性范圍縮小，線性反應時間縮短，樣品內(nèi)源性干擾、基質(zhì)效應增加、旁路反應會增強，方法特異性也下降。若比例減少，檢測信號偏低，信噪比（噪音／信號）增大，當儀器精度不高時，會加大測量誤差。

（2）改動樣品試劑比例，對某些反應有影響。如堿性磷酸酶（AI_P），有文獻報道：當樣品試劑比例從1：25降至1：50時，酶活力測定值增加，再低于1：50時不再增加。這一效應可能是較高稀釋度下AIJP多聚體解聚的結(jié)果。體液樣品稀釋也可能對測定結(jié)果產(chǎn)生影響：④大多數(shù)蛋白質(zhì)在濃溶液中的分子構(gòu)象比稀溶液中穩(wěn)定，樣品稀釋可影響酶的穩(wěn)定性。（2）降低樣品中內(nèi)源性抑制劑或激動劑的濃度，如以蒸餾水稀釋血清，可能因降低血清中*的激動劑氯離子的濃度，致測定*結(jié)果偏低；隨血清稀釋倍數(shù)增加，肌酸激酶測定活力增加，可能與降低樣品中AMt，、*等內(nèi)源性抑制劑有關(guān)。

（3）雙試劑時要兼顧R1、R2和樣品三者的比例，尤其不宜改動試劑間的比例。R2要考慮儀器規(guī)定的加液zui小體積，同一試劑瓶死體積下分液量小而浪費大的經(jīng)濟問題等。

4．稀釋（水）量在加樣或加試劑時，加入去離子水或可以的液體。它的主要用途有兩個。一是用于濃縮試劑的稀釋，或樣品、校準品的稀釋。二是在樣品加量小的時候用來沖洗樣品探針，減小攜帶誤差；但用量不宜太多，以免稀釋試劑影響反應。要把稀釋水量納入樣品試劑比例和反應液總體積考慮。必要時，干粉試劑復溶也要考慮此因素。

四、試劑空白（Reagent blank）監(jiān)測參數(shù)

無樣品或以水代替樣品在反應過程中觀察試劑空白值或其變化情況，主要用于監(jiān)測試劑質(zhì)量及儀器穩(wěn)定性，利用試劑空白對試劑本身或反應漂移引起的誤差進行補償，用以校正△A或△A/min。它與測定波長、光徑大小、不同試劑及配方和樣品試劑比例等有關(guān)，不能盲目套用，必要時宜實際測定。

1．試劑吸光度上限和下限定點監(jiān)測試劑的吸光度。它常用規(guī)定波長及光徑下的吸光度值表示。儀器的試劑空白檢測點因儀器和測定方法的不同而有差異。終點法常在PO點讀數(shù)，連續(xù)監(jiān)測法常以反應監(jiān)測起始點來判讀。儀器在試劑空白檢測及相關(guān)的校準測定時，若監(jiān)測到超過此參數(shù)的限值，則提示試劑失效或校準無效。反應吸光度向上的試驗取上限值：如Trinder反應以酚或2-羥-3，5-二氯苯磺酸等和4-氨基*作用，生成紅色色素，試劑有一定的自發(fā)氧化，其試劑一般要求試劑吸光度上限≤0. 1-0. 4。以結(jié)合型硝基苯衍生物作為底物的ALP和GGT常要求≤0.6~0.8。反應吸光度向下的試驗取下限值：如以NADH或NADPH為輔酶的ALT和Urea（紫外法）等試驗，一般要求試劑吸光度下限≥1．0。

2．試劑空白速率顧名思義，它是在反應過程中對試劑空白的變化速率作連續(xù)監(jiān)測，其數(shù)值在樣品測定結(jié)果中自動扣除。試劑中可能混有的其他雜酶或干擾物對試劑空白速率有影響。在酶促反應中，試劑空白速率也是試劑在監(jiān)測過程中底物自發(fā)降解的結(jié)果。底物為還原型輔酶者，本身不穩(wěn)定而分解，多呈下降趨勢；以硝基*或苯胺的衍生物作底物，在堿性環(huán)境中自發(fā)水解成被測物質(zhì)，多呈上升趨勢。此參數(shù)主要用于連續(xù)監(jiān)測法。一般認為酶活性測定的試劑空白速率（△A/min）應≤0. 001~0.003。由于試劑空白速率與儀器檢測下限、正常參考范圍下限等指標有關(guān)，有時也以濃度單位表示。要根據(jù)K值、儀器穩(wěn)定性、方法允許變異而定。例如，ALT或AST40U/L以下活力濃度的分析誤差應≤10％，其試劑空白速率應≤4．0U／L。一些儀器的程序參數(shù)中沒有此參數(shù)，但我們應在試劑空白的測定資料中關(guān)注它，若資料波動大，須查找試劑或儀器原因。

3．試劑空白的日常監(jiān)測測定方法設(shè)置了試劑空白的項目，都要先行作試劑空白測定，在樣品測定計算中自動扣除。由于試劑空白不是在每一個樣品測定中實時測定并扣除，當樣品測定中試劑的變化在未達到參數(shù)設(shè)置限值時不易發(fā)現(xiàn)，試劑空白扣除會產(chǎn)生誤差。所以，應根據(jù)試劑的穩(wěn)定性確定試劑空白及相關(guān)的校準的測定頻率。連續(xù)監(jiān)測法的試劑應每天（尤其在換另瓶或另批號試劑時）常規(guī)測定此參數(shù)。對樣品的異常結(jié)果．也應及時對其測定吸光度資料（包括與試劑空白有關(guān)的資料，例如PO點讀數(shù)）觀察分析。

4.有的半自動生化儀沒有試劑吸光度上限和下限設(shè)定，但一般在測定屏幕都顯示初始吸光度值，應人工加以判斷。酶活力測定結(jié)果呈負值，有時可能與試劑空白錯誤有關(guān)。

5．試劑吸光度上限和下限不是試劑質(zhì)量的*指針。因此，一定的校準頻率和室內(nèi)質(zhì)控是質(zhì)量保證的必需手段。我們在實際工作中就遇到酶活力測定的試劑空白數(shù)據(jù)在規(guī)定限值內(nèi)，但質(zhì)控物測定結(jié)果連續(xù)偏低，病人結(jié)果因每天標本少而難以判斷，zui后發(fā)現(xiàn)是試劑質(zhì)量下降。

五、波長的選擇及測定模式

波長（Wave 1ength）的正確選擇有利于提高測定的靈敏度和減少測定誤差。光度學方法有單波長和雙波長之分，有的儀器可用三波長、甚至多波長，以及兩波長比率等。有的儀器可作導數(shù)光譜分析。單波長測定易受樣品溶血、黃疸、脂濁等因素干擾。雙波長測定可以通過副波長加以修正，減少甚至消除干擾因素，提高測定準確性。采用同光束雙波長，亦有利于排除光源強度變化對結(jié)果的影響。

1．測定波長選擇有三個主要條件：

（1）待測物質(zhì)在該波長下的光吸收zui大。

（2）其吸收峰宜較寬而鈍，而不是處于尖峰或陡肩，一般不選光譜中的末端吸收峰，換句話說，該吸收峰處的吸光度隨波長變化較小。

（3）常見干擾物在該波長下的光吸收zui小。試劑盒說明一般已提供波長參數(shù)。實際波長選擇需要了解待測物質(zhì)和干擾組分對不同波長單色光的吸收程度，即以波長為橫坐標、吸光度為縱坐標作吸收光譜曲線（光吸收曲線）。

采用透射免疫比濁法，免疫復合物大小約35~100mn之間，于波長290~410nm下有zui大吸收峰，常取340nm；如用膠乳增強免疫濁度法，理想的檢測波長可增至可見光區(qū)。

2．雙波長測定當待測物質(zhì)與干擾組分的吸收光譜互相重疊、出現(xiàn)非特異光吸收，或因反應液混濁出現(xiàn)光散射時，可以采用雙波長（或多波長）測定。雙波長測定的原則是根據(jù)干擾組分和待測物質(zhì)吸收光譜的峰形特征，選擇兩個波長和 ，使干擾組分在這兩個波長處的吸光系數(shù)相等，而使待測物質(zhì)在兩波長處的吸光系數(shù)有顯著差別。以兩波長分別測定分析溶液的吸光度，以兩個吸光度值之差（△A）計算。雙波長選擇常見：血紅蛋白340nm和380nm波長吸光度相同，以NADH或NADPH作為測定底物或產(chǎn)物的試驗常采用340／380nm；有的也．采用340／405nm。ALP和GGT常使405/476nm，Trinder反應多選取520／600nm或550/660nm．免疫比濁常選用340／700nm等。

連續(xù)監(jiān)測法中，要注意雙波長測定有兩種類型的機型：主波長全程監(jiān)測副波長單點監(jiān)測，和雙波長全程監(jiān)測。不僅因為后者的準確性優(yōu)于前者，而且因為酶活性測定的K值計算與波長及摩爾吸光系數(shù)有關(guān)，更顯重要。

副波長單點監(jiān)測：試劑和樣品混合后，雙波長只測一點，此后只用主波長連續(xù)監(jiān)測；計算時，全部x主吸光度值均減去同一λ副吸光度值。K值計算代入主波長摩爾吸光系數(shù)即可。機型如Monarch 1000 ，Technicon RA 1000等。

雙波長全程監(jiān)測：全程每～測定點均用雙波長同測，并各自用λ主吸光度值減去λ副吸光度值。因為所測指示酶或產(chǎn)物在λ副波長時也存在一定的吸光系數(shù)，K值計算代入的摩爾吸光系數(shù)值應采用ε主減去ε副。如NADH的ε 為6．22×10 ， 為1．33×10 ，ALP產(chǎn)物ε 為18.5x×10 ，ε 為0.2×10 很小；GGT產(chǎn)物在副波長處無吸光系數(shù)。


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