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上海酶聯(lián)生物研究所
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：546發(fā)布時間：2012-9-11
以抗體技術(shù)為基礎(chǔ)的免疫檢測應(yīng)用和相關(guān)的疾病治療領(lǐng)域如癌癥，自發(fā)免疫紊亂等一直推動著抗體篩選研究的發(fā)展。單克隆抗體是會由特定的細胞系分泌到上清液中，而對上清液的篩選則成為了藥物研發(fā)的核心領(lǐng)域。
均相結(jié)合實驗
盡管ELISA和流式細胞儀等傳統(tǒng)手段被廣泛應(yīng)用，但是這兩種檢測手段都存在很多的局限性，特別是對細胞表面低豐度抗原的檢測。同時，這兩種平臺需要很繁瑣的洗板和孵育的步驟而且耗費大量細胞和時間才能獲取數(shù)據(jù)。為了解決這些技術(shù)瓶頸，我們開發(fā)了mirrorball這個高靈敏度檢測平臺和“即混即讀”的實驗方案，這樣就大幅度的提高了抗體篩選的通量并且避免了繁瑣的實驗步驟。您所需要進行的實驗僅僅是將所有的反應(yīng)物一次性的加入到孔中并孵育一段時間。這里待檢測的可以是結(jié)合在微球上的可溶性抗原也可以是細胞表面表達的抗原，一旦反應(yīng)達到平衡狀態(tài)，那么結(jié)合了一抗的珠子和細胞可以很快的通過熒光標(biāo)記的二抗來檢測到。由于mirrorball的這種高靈敏度特性，使得我們可以比流式和傳統(tǒng)ELISA更早的檢測樣品，并且只需要5ul左右的待測樣品。均相反應(yīng)體系可以大幅度的減少試劑的消耗，特別適用于研究昂貴和低豐度的抗原。mirrorball的數(shù)據(jù)掃描和獲取
微孔板進行掃描時使用488nm和640nm的激發(fā)光。使用TTP LabTech公司的閾值算法和兩種形態(tài)熒光參數(shù)，每孔中的細胞都會 “on-the-fly”。。而使用mirrorball的圖像Cellista™軟件，我們可以進行全景掃描，得到數(shù)據(jù)可視化中的各種數(shù)據(jù)圖形（包括直方圖或散點圖，3D熒光強度分布圖）和整個微孔的圖片。
ABI 8200的數(shù)據(jù)掃描和獲取
使用640 nm激光掃描樣品，進行細胞計數(shù)和熒光總強度檢測，數(shù)據(jù)導(dǎo)出到Excel文件和處理。實驗數(shù)據(jù)僅僅收集了孔中心1 mm2面積區(qū)域。
數(shù)據(jù)結(jié)果
為了比較mirrorball和ABI 8200在EGFR檢測靈敏度方面的差異性，將A431細胞與梯度稀釋的EGFR一抗以及AlexaFluor647標(biāo)記的goat anti-mouse IgG二抗共同孵育。 在用mirrorball分析時，用CFSE對細胞進行染色，預(yù)先定位細胞并進行計數(shù)，細胞量為384孔板每孔2000個。對于ABI的8200， A431細胞量為每孔8000個接種。
均相抗體結(jié)合實驗的分析
mirrorball和ABI 8200 FMAT 都在設(shè)計上融入了很多適用于均相結(jié)合實驗的特性。通過使用激光作為激發(fā)光源和光電倍增管作為檢測裝置，這使得它們能夠檢測到低親和力的抗體和低豐度的抗原的結(jié)合。兩個系統(tǒng)都在光路設(shè)計上zui大程度的降低了背景熒光并在掃描讀數(shù)的時候大幅度的提高了信噪比。在這個應(yīng)用介紹里我們特別的比較了兩個平臺 mirrorball和ABI 8200 在通過細胞水平實驗進行抗體篩選時的性能優(yōu)異性。通過對比，我們展示了mirrorball的多重?zé)晒鈾z測能力，這使多重抗原標(biāo)記并同時檢測成為了可能。
方法
細胞系和培養(yǎng)方法
在這項研究中，比較了mirrorball和ABI8200系統(tǒng)在進行A431細胞EGFR抗體結(jié)合實驗時的。 A431細胞在EMEM培養(yǎng)（EBSS）（Sigma公司）含10%胎牛血清，2mM*（Sigma公司），1X非必需氨基酸（NEAA）（Sigma）和100 U / mL*以及100 U / ml*。 A431細胞培養(yǎng)至80%匯合度時用0.25%*和EDTA收集，洗凈懸浮在培養(yǎng)基中。除非另有說明，培養(yǎng)試劑均購自Life Technology。
抗體和試劑
檢測抗體，鼠抗人表皮生長因子抗體（抗EGFR抗體），購自Merck Chmicals Ltd（#GR01）。山羊抗鼠IgG，AlexaFluor647 （#A21235）由Life Technologies公司提供。
CFSE標(biāo)記
5（6） - 羧基二乙酸N -琥珀酰亞胺酯（CFSE）（Sigma公司）配置為100mM在DMSO溶液里。 CFSE（10nM）被添加到細胞里并在室溫中孵育10分鐘。用4%FBS的PBS（2ml）終止反應(yīng)。進一步孵化，于37° C下10分鐘后，細胞1000 x g離心5分鐘。
EGFR實驗
抗EGFR抗體在培養(yǎng)基中梯度稀釋，并添加20ul到384孔板中（Costar#3712）。對于mirrorball系統(tǒng)，暫停用CFSE標(biāo)記A431細胞含有1 ×105個細胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647二抗。對于ABI的8200平臺，準備A431細胞的懸浮液包含4× 105細胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647。首先，加入在各孔中加入20uL混合有熒光二抗的細胞懸液在37℃，孵育2小時。分別在mirrorball和ABI8200平臺上進行掃描并測定結(jié)合有EGFR抗體的細胞數(shù)量。zui后，mirrorball和ABI8200的濃度分別為2000細胞/孔和8000
商鋪：http://www.niunang.cn/st32881/
主營產(chǎn)品：ELISA試劑盒，人ELISA試劑盒，小鼠ELISA試劑盒，豚鼠ELISA試劑盒，兔ELISA試劑盒，羊ELISA試劑盒，牛ELISA試劑盒，雞ELISA試劑盒，鴨ELISA試劑盒，植物ELISA試劑盒
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