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公司動(dòng)態(tài)

細(xì)胞樣本的前處理

閱讀:91發(fā)布時(shí)間:2015-8-17

一、勻漿介質(zhì)

一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據(jù)樣本及測(cè)定指標(biāo)的情況自行設(shè)定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境。

二、細(xì)胞樣本的前處理:

1、細(xì)胞沉淀的收集:

① 懸浮細(xì)胞: 對(duì)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,直接通過(guò)離心收集細(xì)胞沉淀,將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,棄上清留細(xì)胞沉淀。

② 貼壁細(xì)胞: 對(duì)于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞,用*將細(xì)胞消化下來(lái),或用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來(lái),將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,棄上清留細(xì)胞沉淀。

我們一般建議客戶,細(xì)胞密度不要小于一百萬(wàn)個(gè)/ml。

2、細(xì)胞沉淀的洗滌:

在細(xì)胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS (等滲), 輕輕顛倒混勻,將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,棄上清留細(xì)胞沉淀。

重復(fù)上述操作反復(fù)洗滌1~2次。

3、勻漿的方式:手工勻漿,超聲破碎,裂解液裂解,反復(fù)凍融。

① 手工勻漿:在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據(jù)所測(cè)指標(biāo)的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細(xì)胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml),混勻,將細(xì)胞懸浮于PBS中,用移液器將細(xì)胞懸浮液移至玻璃勻漿管中(2ml玻璃勻漿管),將玻璃勻漿管置于冰水混合物中,手動(dòng)勻漿3分鐘,然后取破碎好的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行測(cè)定。

② 超聲破碎:

在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據(jù)所測(cè)指標(biāo)的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細(xì)胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml),混勻,將細(xì)胞懸浮于PBS中,在冰水浴條件下進(jìn)行如下操作:

     a、用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎,也可用國(guó)產(chǎn)超聲波發(fā)生儀,用400安培,5秒/次,間隙10秒反復(fù)3~5次。

      b、用超聲細(xì)胞破碎儀,300W功率,每次超聲3~5秒,間隔30秒,重復(fù)4~5次。

③ 裂解液裂解 

常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的,或者說(shuō)作用力量強(qiáng)弱不同。

1、SDS屬于離子型去垢劑,zui厲害,基本可以把細(xì)胞*破掉,DNA會(huì)釋放出來(lái),裂解液變得很粘稠。

2、NP-40是很溫和的去垢劑,1%濃度的基本可以破壞掉胞膜,而對(duì)核膜破壞的作用弱,結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。

3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間,偏向于NP40,也是常用的細(xì)胞裂解液成分之一,在保護(hù)蛋白活性方面有一定作用(SDS基本會(huì)使蛋白變性失活)。

去垢劑屬性只是一方面,buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關(guān)鍵因素

由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對(duì)酶活力的測(cè)定有一定的影響,一般不*用裂解液進(jìn)行裂解。

④ 反復(fù)凍融:

在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據(jù)所測(cè)指標(biāo)的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細(xì)胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml),混勻,將細(xì)胞懸浮于PBS中,放低溫冰箱中結(jié)冰,溶解,再結(jié)冰,再溶解,反復(fù)3次左右)。

                由于反復(fù)凍融對(duì)酶活力影響較大,一般不*使用



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產(chǎn)品:

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氟硅唑標(biāo)準(zhǔn)品|對(duì)照品,cas:85509-19-9
CAS:77-60-1,劍麻皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品
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CAS:64421-28-9,山梔苷甲酯標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品
CAS:1173-88-2,*標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品價(jià)格
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CAS:96315-53-6,虎掌草皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品
殺線威標(biāo)準(zhǔn)品|對(duì)照品
CAS:487-39-8,連翹脂素標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品
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CAS:80651-76-9,桑根酮C標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品
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CAS:66575-29-9,佛司可林標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品
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CAS:218916-52-0,千金子二萜醇二乙酰苯甲酰酯標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品
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毛蕊花糖苷(麥角甾苷)對(duì)照品/標(biāo)準(zhǔn)品
*對(duì)照品/標(biāo)準(zhǔn)品
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多環(huán)芳烴同位素混標(biāo)PAH-Mix9標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品價(jià)格
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CAS:19685-10-0,10-甲氧基*標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品
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CAS:11088-09-8,*次堿標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品
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梭菌增菌對(duì)照培養(yǎng)基
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