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中級(jí)會(huì)員 | 第16年

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通蔚生物有關(guān)質(zhì)粒DNA提取及實(shí)驗(yàn)步驟有哪些

時(shí)間:2023/10/23閱讀:1269
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  質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)步驟:
  一、搖菌培養(yǎng)
  1. 將鑒定測(cè)序正確的克隆菌液涂在LB固體平板。
  2. 置于37℃恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)12-17h,待長(zhǎng)出菌落。
  3. 滅菌15ml離心管內(nèi)加入5ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基,編號(hào)標(biāo)記。
  4. 挑取單克隆菌團(tuán)放置液體培養(yǎng)基,每個(gè)培養(yǎng)基放置1個(gè)菌落。
  5. 37℃,180rpm,振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

  二、質(zhì)粒DNA的純化

  1. 將之前提取好的質(zhì)粒放入1.5ml離心管中,加入1/10體積的3mol/L 無(wú)菌乙酸鈉溶液。
  2. 加入2倍體積的無(wú)水乙醇,放置于-20℃沉淀4-6h或過(guò)夜。
  3. 4℃,高速離心機(jī)14000rpm,離心20min。
  4. 棄去上清,70%乙醇洗2次。
  5. 空氣干燥,可置超凈工作臺(tái)干燥。
  6. 加200ul無(wú)菌水溶液干燥后所得沉淀,即為質(zhì)粒溶液。
  7. 紫外分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒濃度和產(chǎn)量。測(cè)量OD260和OD280的值:質(zhì)粒DNA濃度=OD260×50×稀釋倍數(shù)(μg/mL)。

  三、質(zhì)粒DNA提取常見問(wèn)題

  1.  時(shí)間控制問(wèn)題裂解時(shí)間太長(zhǎng),加入溶液P2后裂解時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5 分鐘;吸附時(shí)間不夠;溶解時(shí)間不夠都會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)失敗。
  2.  大腸桿菌老化建議涂布平板培養(yǎng)后,重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。
  3.  質(zhì)粒拷貝數(shù)低由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA 提取量低,可更換具體相同功能的高拷貝數(shù)載體。
  4.  溶液使用不當(dāng)溶液P2、P3 在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁,應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液,才能使用。
  5.  吸附柱過(guò)載不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的質(zhì)粒量很大,請(qǐng)分多次提取。若用富集培養(yǎng)基,例如TB 或者 ×YT 菌液體積必須減少;若質(zhì)?;蛩拗骶欠浅8叩目截悢?shù)或生長(zhǎng)率,則需調(diào)整LB 培養(yǎng)液體積。
  6.  質(zhì)粒未全部溶解洗脫溶解質(zhì)粒時(shí),可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。
  7.  乙醇?xì)埩羝匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體,樹脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹脂,再加入洗脫緩沖液。
  8.  洗脫液加入位置不正確洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到洗脫效率。

  9.  洗脫液不合適DNA 只在低鹽溶液中才能被洗脫。洗脫效率取決于pH 值。洗脫效率在pH7.0~ 8.5 間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其 pH 值在此范圍內(nèi),如果pH 過(guò)低可能性導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加暖至 60 ℃后使用有利于提高洗脫效率。

     10. 洗脫體積太小洗脫體積對(duì)來(lái)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高,但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

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