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技術(shù)文章

親和柱層析法提純mRNA

閱讀：561發(fā)布時(shí)間：2014-12-26

主要試劑
柱材Oliga(dT）－纖維素
上樣液：20mM  Tris-HCL(pH 7.6)
          0.5M   NaCL
          1mM   EDTA (pH 8.0)
          0.1%   十二烷基肌氨酸鈉（SLS）
洗脫液：10mM Tris-HCL(pH 7.6)
          1mM EDTA  (pH 8.0)
          0.05% SDS
主要設(shè)備
層析系統(tǒng)，水浴，離心機(jī)，取液器，分光光度計(jì)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. DEPC處理層析柱。
2. 0.1M NaOH處理Oliga(dT）－纖維素。
3. 用1×上樣液洗柱至pH< 8.0。
4. 無菌水溶解RNA，65℃溫浴5分鐘后，迅速冷卻至室溫，加等體積2×上樣液，上樣，分部收集。
5. 1倍體積1×上樣液洗柱，分部收集。
6. OD260沉淀收集液，確定收集液的該值是否接近0，如該值仍很大，則上樣液繼續(xù)洗柱，直至該值接近0。
7. 2－3倍柱床體積的洗脫液，洗柱，分部收集。
8. 測(cè)定各收集管的OD260，將有吸光值的各管合并。
9. 在洗脫液中加入0.1體積的NaAC，1體積的異丙醇，－20℃沉淀過夜，12000g 離心10min，75%乙醇洗沉淀，真空干燥。
10. 提取mRNA質(zhì)量的分光光度計(jì)檢測(cè)，將所提mRAN分別在260，280nm比色，要求A：OD260％/ OD280％不小于2.0及40μg所提樣品在OD260％的值為1 .
11. 提取mRNA質(zhì)量的電泳檢測(cè)，在1%的變性膠上，EB染色后，mRNA應(yīng)在0.5-8Kb間均勻著色，1.5-2Kb間著色較強(qiáng)。


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