C5活化是過敏毒素釋放和膜攻擊殺傷細(xì)胞機(jī)制的開始。C5活化后產(chǎn)生C和C5b兩個(gè)片段，C被血清羧肽酶N裂解成無活性的C-desarg。C對(duì)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞有趨化作用，并參與初次免疫應(yīng)答，控制抗體合成和感染的發(fā)生及發(fā)展。因此檢測(cè)C5裂解產(chǎn)物對(duì)臨床監(jiān)視病情發(fā)展有一定的意義。
1．原理 將抗C單克隆抗體包被固相聚苯乙烯板，加入經(jīng)聚乙二醇（PEG）處理的待測(cè)樣本，然后依次加入兔抗人C-IgC多克隆抗體和過氧化物酶標(biāo)記的豬抗兔IsC，再加入底物2，2’—連氮—雙（3—乙基苯駢唑啉-6-磺酸鹽）（ABTS）和H202顯色，于酶標(biāo)儀405mn處測(cè)定每分鐘光密度增加量（0D/rain），以O(shè)D/rain為縱坐標(biāo)，C標(biāo)準(zhǔn)晶濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，求出待測(cè)樣本中C的含量。
2．主要試劑
（1）PBSPH7．2，9mmol/L磷酸鹽緩沖液（PB）含140mmol/L NaCl。
（2）PBS-Tween pH7．2PBS含0．05％Tween20，簡(jiǎn)稱PBS-T。
（3）底物溶液：100mL 2mmol/L ABTS溶液中含100mmol/L醋酸鈉，50mmol/L磷酸鈉，2．5mmol/L H202。
（4）沉淀劑：①：100mL pH8．0，20mmoL/L Tris-*-HCl緩沖液中含20g PEG 4 000，0.8g Rivanol；沉淀劑②：100mLp H2．0.100mmol／L*-HCl緩沖液中含20g PEG4000。
3．方法
（1）用鹽和/或PEG沉淀血漿中C5：在微量反應(yīng)板中加入EDTA抗凝血漿100gL，然后加人100/uL沉淀劑，用下述三種方法中任何一種沉淀血漿中C5。
1）在微量反應(yīng)板中加入100uL 2mol/L HCl與100uL EDTA抗凝血漿混合，室溫5h.加入HCl后血漿pH值在1．0—1．5之間。上清用4倍體積的0．29mol/L Tris調(diào)節(jié)至pH7．1-7．4。
2）在微量反應(yīng)板中加入100uL沉淀劑①，室溫30rain。
3）在微量反應(yīng)板中加入100uL沉淀劑②（血漿pH值在4．0—4．5之間）。室溫30rain。 用方法2）和方法3）沉淀C5后，上清加入4倍體積的含0．05％Tween 20 pH7，10．21mol/L Tris-HCl緩沖液，血漿被稀釋10倍。
（2）用抗C單克隆抗體（McAb）包被酶標(biāo)反應(yīng)板：用pHl0．6，50mmol/L碳酸鈉溶液將抗CMcAb稀釋成10ug/mL，每孔加100uL，4℃ 16h。次日取出每孔加含1％（W/V）明膠的PBSl50gL，室溫lmin；然后用PBS-Tween 20洗滌一次。
（3）樣本中CSa的檢測(cè)：洗滌后的酶標(biāo)板，每孔加入方法1）、2）或3）處理的血漿樣本zoot&，4℃16h,用PBS-Tween20洗滌1次，每孔加入用含0．1％明膠的PBS-T稀釋的兔抗人CSa-IgC．多克隆抗體（46ug/mL）100t&,室溫2h，用PBS-Tween20洗滌3次；每孔加入用含0．1％明膠PBS-T稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的豬抗兔IgClOOt&（稀釋前l(fā)mL過氧化物酶偶聯(lián)物內(nèi)加100ul無關(guān)鼠McAb、10ul人血漿或10ul激活的人血清處理），室溫2min，每孔用PBS-Tween20洗滌4次；每孔加入底物溶液100ul，lmin后以PBS-T調(diào)零，每3min于酶標(biāo)儀405nm處讀取OD值。以O(shè)D/min增加量計(jì)算過氧化物酶活性。其活性與血漿中C含量呈正相關(guān)。本法zui低檢測(cè)極限為1ng/mL，此法未檢測(cè)出正常人新鮮血漿中的C。
（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取已知濃度純化的C，對(duì)倍稀釋成一系列不同的濃度（0.039—5.000ng/mL），分別加入包被有抗CMcAb的酶標(biāo)板中，然后按上述方法依次加入兔抗人C-IgC和過氧化物酶偶聯(lián)的豬抗兔IgC及過氧化物酶的底物，以PBS-Tween調(diào)零點(diǎn)，讀取OD40s/min增加量，以C（desarg）濃度為橫坐標(biāo)，OD40s/minx 200為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)取6個(gè)已知濃度的純化C。
會(huì)員1.png)