補(bǔ)體活化zui終形成補(bǔ)體終末復(fù)合物C5b-9。C5b-9存在于靶細(xì)胞膜上為MC5b-9，導(dǎo)致細(xì)胞膜攻擊和損傷；C5b-9若存在于體液中則與S蛋白結(jié)合形成失活的SC5b-9。終末復(fù)合物的檢測直接反映體內(nèi)補(bǔ)體活化程度。
1．原理 補(bǔ)體C5-C9活化后，產(chǎn)生C5b-9復(fù)合物新生抗原。用抗C5b-9新生抗原的McAb包被酶標(biāo)反應(yīng)板，加入待檢樣本，然后依次加入親和層析純化的兔抗人C5b-9-IgC多克隆抗體、*標(biāo)記的驢抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的*—親合素復(fù)合物及底物鄰苯二胺，反應(yīng)后于酶標(biāo)儀492nm處讀取吸光度，其吸光度與C5b-9含量呈正相關(guān)。
2．主要試劑 ①洗滌液：20mmol/L Tfis含500mmol/L NaCl，0．05％Tween 20pH7．5；②稀釋液：20mmol/L Tfis含150mmol NaCl，0．05％Tween 20，pH7．5；③*標(biāo)記的驢抗兔IgC（Amershan Bratmscheig）；④親合素—*標(biāo)記的辣根過氧化物酶復(fù)合物（Amershan Braunscheig）；⑤封閉液為含0．3％Tween 20的洗滌液；⑥底物緩沖液：pH5．0醋酸緩沖液。按0．43mg/mL加入鄰苯二胺和終濃度為0．02％的H202。
3．操作步驟
（1）抗體的包被：用pH9．4，0．05mol/L碳酸鈉稀釋抗C5b-9復(fù)合物新生抗原的McAb，濃度為2～3ug/mL。將稀釋的McAb加入酶標(biāo)板，100uL/孔，放人濕盒，20％16～24h。次日取出用洗滌液洗4次，每孔加封閉液100/uL，22％20rain，然后用洗滌液洗1次。
（2）待檢樣本的檢測：待檢樣本用終濃度為10mmol/L EDTA抗凝，取血漿并將其稀釋，加入包被有抗體的酶標(biāo)板中，每孔100uL，放人濕盒37℃ 45min，取出用洗滌液洗4次，加入100uL親和層析純化的兔抗C5b-91gC多克隆抗體（1：1 000），37℃ 30min，每孔加洗滌液洗4次，加入100uL*標(biāo)記的驢抗兔IgG（1：1 000），37℃ 30min，用洗滌液洗4次，加人100uL辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素—*復(fù)合物（1：1 000），37℃20rain，洗滌4次，每孔加底物液150ul，37℃10～15min，加入50uL 4mol/L H2S04終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀492nm處讀取吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出血漿中C5b-9的含量。每次試驗(yàn)都應(yīng)做抗體和抗原對(duì)照。背景吸收值控制在0．04±0．025。
（3）ELISA C5b-9標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將純化的SC5b-9稀釋為25ng/mL、lOOng/mL、400ng/mL、1 600ng/mL、6 400ng/mL 5個(gè)濃度；將MC5b-9 1．5ng/mL、6.25ng/mL、25ng/mL、lOOng/mL、400ng/mL 5個(gè)濃度，分別加入包被有抗體的酶標(biāo)板中，隨后操作同待檢樣本檢測，然后以吸光度為縱坐標(biāo)，SC5b-9、MC5b-9濃度為橫坐標(biāo)作圖。本法zui低測定極限MC5b-9為3ng/mL；SC5b-9為20ng/mL。100名健康獻(xiàn)血員中65人SC5b-9在100～250ng/mL，少數(shù)為600ng/mL，其余低于100ng/mL。
會(huì)員1.png)