zui常方法有：
1、混合酸酐方法；
2、CDI方法；
3、NHS酯方法。
混合酸酐方法通常既簡(jiǎn)單而又直接，小分子的羧基轉(zhuǎn)變成可與蛋白氨基反應(yīng)的酸酐。反應(yīng)時(shí)，一般每摩爾蛋白中加入10～20mol小分子。這種方法已被用于雌二醇—HRP，可的松—b—半乳糖苷酶等酶結(jié)合物的制備，產(chǎn)率約為25％。下面舉一例子說明混合酸酐方法是如何進(jìn)行的。
1．混合酸酐方法
目的：用于methotrexate（MTX）與p—半乳糖苷酶結(jié)合物的制備
操作步驟：
（1）溶解5．8mgMTX于0．1ml DMF中，冷卻至10~C，加入2／ll isobutyl choroformate，10~C攪拌30min；
（2）溶解1．5mgp—半乳糖苷酶于2ml 50mmol／LNazC03溶液中；
（3）10~C反應(yīng)4h，按要求加NaOH使溶液pH保持在9．0，然后4℃過夜；
（4）用含100retool／L NaCl，10retool／L MgClz和10mmol／L 2—巰基乙醇的50 mmol／L Tris—醋酸緩沖液（pH7．5）平衡的SephadexG-25過濾分離結(jié)合物和未結(jié)合的化合物，收集含酶的部分，進(jìn)一步純化后，加0．1％（W／V）BSA和0．02％（W／y）NaN3
CDI方法較為常用，結(jié)合物得率約為20％，已被用于小分子與p—半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等的連接。CDI方法結(jié)合反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，載體蛋白、過量的小分子和交聯(lián)試劑在pH 6．0的緩沖液中至少攪拌30rain。
NHS酯方法其實(shí)是CDI方法的一個(gè)變異方法，即其先使DCC或另一種CDINHS酯化。這種方法可用于水溶性CDI不能使用的結(jié)合反應(yīng)。下面舉例說明。
2．N—羥琥珀酰亞胺酯方法
目的：用于*與p—半乳糖苷酶結(jié)合物的制備。
操作步驟：
（1）溶解*—11—半琥珀酸鹽于dioxane中至100 mmol／L濃度；
（2）在200 mmol／LDCC存在下，與100 mmol／LN—羥琥珀酰亞胺14~C反應(yīng)16h；
（3）薄層層析純化所形成的酯，展開劑為氯仿：乙醇（9：1）；
（4）按*／酶為10／1的摩爾比將上述酯加入到b—半乳糖苷酶溶液（于50 mmol／L，pH 7．4）中。
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