一、目的及要求
1、了解質(zhì)粒作為載體在基因工程中的作用
2、熟記提取質(zhì)粒的基本原理，學(xué)習(xí)提取過(guò)程和方法
3、為下一步實(shí)驗(yàn)提供高純度的DNA 樣品
二、原理
1、質(zhì)粒（Plasmid）：獨(dú)立于染色體以外的雙鏈、閉合、環(huán)狀DNA，可自我復(fù)制。為基因工程中的常用載體（Vector）
2、作為載體的質(zhì)粒需具備以下特點(diǎn)：
1） 能自主復(fù)制。
2） 具有多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)，又稱(chēng)為多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sites, MCS），便于外源基因的插入。
3） 具有1 個(gè)以上的篩選標(biāo)記（抗性基因）。
4） 分子量相對(duì)較小，多拷貝。
5） 非結(jié)合性質(zhì)粒。
6） 轉(zhuǎn)化效率高。
目前已有一系列符合上述要求的質(zhì)粒作為商品供應(yīng)。
3、大腸桿菌中提取純化質(zhì)粒的主要步驟：
1） 細(xì)菌的培養(yǎng)：LB 培養(yǎng)基+氨芐*O.D600=0.4 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期O.D600=0.6 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期
2）細(xì)菌的收集和裂解
收集：離心，STE 液洗1-2 次，去除代謝物
裂解：SDS 法、堿裂解法、煮沸法
堿裂解法：EDTA 破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜→SDS 裂解細(xì)胞膜→NaOH 使核酸、蛋白質(zhì)變性。
3）質(zhì)粒的分離和純化
加入酸液，質(zhì)粒DNA、小分子RNA 復(fù)性（可溶），染色體DNA、高分子量RNA、K+/SDS/蛋白質(zhì)/膜復(fù)合物沉淀，離心棄除；酚:氯仿抽提去除蛋白質(zhì)；RNAse去除殘留小分子RNA。
三、試劑：
略
四、操作：
1．將0.2ml 含重組質(zhì)粒pIL 的大腸桿菌接種于2.5ml LB 培養(yǎng)基（含Amp 100ug/ml）中，37℃、150rpm 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。作用：加Amp 的目的為使含Amp 抗性基因的細(xì)菌選擇性生長(zhǎng)。
2．取1.5ml 菌液置于1.5ml EP 管中，15,000rpm 離心30 秒，棄上清，將培養(yǎng)液盡量控干。
作用：沉淀細(xì)菌。注意：控干時(shí)將吸水紙卷成圓柱狀，沿管壁輕輕吸取水珠?？馗蓵r(shí)不要觸及細(xì)菌沉淀。
3．加入1ml STE 溶液，漩渦振蕩器上振蕩懸菌，15,000rpm 離心5min，棄上清，控干。
作用：去除培養(yǎng)基中殘留的細(xì)菌代謝物。
4．加入100ul 溶液Ⅰ，震蕩懸菌，室溫放置5min。
作用：Glucose--增加溶液粘度，保護(hù)DNA；Tris-HCl--緩沖液；
EDTA--螯合二價(jià)陽(yáng)離子，抑制核酸酶，預(yù)處理細(xì)菌。
注意：在渦振蕩器上震蕩懸菌。
5．加入200ul 溶液Ⅱ，輕輕顛倒混勻5 次，置冰浴5min。
作用：SDS--去污劑，使細(xì)胞裂解；NaOH--變性劑，使蛋白質(zhì)、核酸變性。注意：此時(shí)溶液呈膠胨狀，嚴(yán)格控制混勻次數(shù)和變性時(shí)間。
6．加入150ul 溶液Ⅲ，顛倒混勻，置冰浴10min。
作用：酸液，中和NaOH，使質(zhì)粒DNA、小分子RNA 復(fù)性（可溶），染色體DNA、高分子量RNA、K+/SDS/蛋白質(zhì)/膜復(fù)合物不能復(fù)性而沉淀
注意：此時(shí)溶液出現(xiàn)大量絮狀沉淀
7．15,000rpm 離心5min，將上清400ul 轉(zhuǎn)移至另一干凈EP 管中，棄沉淀。
注意：將槍頭插入溶液*吸取，不要將沉淀吸出，用吸水紙擦拭槍頭。
8．加入240ul 異丙醇（0.6 體積），混勻，置室溫10min。
作用：沉淀核酸（DNA、大分子rRNA、mRNA）和蛋白質(zhì)。
9．15,000rpm 離心10min，棄上清，控干。
10．50ul TE 溶解沉淀，加入50ul 冰預(yù)冷的5M LiCl，混勻，置冰浴10min。
作用：使大分子大分子rRNA、mRNA 沉淀，而DNA 不沉淀。
11．15,000rpm 離心10min，上清100ul 轉(zhuǎn)移至另一EP 管中。
12．加2 倍體積-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，-20℃沉淀10min。
13．15,000rpm 離心10min，棄上清。
14．待乙醇揮發(fā)后，將沉淀溶于20ul TE。將質(zhì)粒DNA 溶液置于-20℃保存。
五、注意事項(xiàng)：
1．嚴(yán)格控制堿變性的時(shí)間時(shí)間，不超過(guò)5 分鐘。因?yàn)?，如質(zhì)粒處于強(qiáng)堿性環(huán)境中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可發(fā)生不可逆變性，導(dǎo)致限制性?xún)?nèi)切酶切割困難。
2．在加入溶液III 后，要充分混勻并置冰上。如未見(jiàn)大量白色沉淀，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)失敗，應(yīng)立即重做。
3．棄上清時(shí)，必須控干即除盡管內(nèi)的液體，在做zui后一步時(shí)，應(yīng)盡量將乙醇揮發(fā)干凈，因?yàn)槿鐨埩糨^多乙醇，以后在做酶切鑒定時(shí)，乙醇會(huì)使限制性?xún)?nèi)切酶失活。但此步的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般在10-15 分鐘左右，可用濾紙條小心吸凈離心管壁上的乙醇液滴以節(jié)省時(shí)間。
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