2012年2月,FDA發(fā)布了期待已久的生物仿制藥指導(dǎo)文件草案[1-3],這三個文件概述了FDA在審批高相似性仿制藥時所考慮的必要程序和要求,嚴(yán)格對仿制藥進(jìn)行類似特征的分析處于審批的核心位置,這一首要步驟表明仿制藥與參照藥高度的相似性.根據(jù)草案的指導(dǎo),在仿制藥和創(chuàng)新藥之間進(jìn)行更為廣泛、強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)與功能方面的對比分析,該結(jié)構(gòu)特征決定了在審批時需要怎樣的臨床與非臨床研究. [1]
仿制藥指紋：生物分析法尋找其結(jié)構(gòu)特征
尋找指紋
FDA指導(dǎo)草案的一個重要特征是識別一種蛋白質(zhì)的“指紋”,通過相似性組合方法測量一系列結(jié)構(gòu)屬性,進(jìn)而確定仿制藥與藥之間的相似性.在某種程度上,這一概念源自于依諾肝素（抗凝血藥）獲得審批的經(jīng)歷,在2010年7月這一低分子量的肝素在沒有臨床試驗的情況下獲得審批.根據(jù)五個標(biāo)準(zhǔn),FDA認(rèn)為其具有與Lovenox相似的活性成分[4],列舉如下：
• 依諾肝素的物、化特性
• 依諾肝素的性質(zhì)和化學(xué)裂解過程
• 依諾肝素成分的性質(zhì)和排布
• 實驗室測量的依諾肝素抗凝血活性
• 藥物對人類作用的某些效果
雖然依諾肝素不是一種蛋白質(zhì),但是它是一種復(fù)雜的生物產(chǎn)品,在理化水平上,它的特征更像重組蛋白產(chǎn)品.
指南草案表明,指紋信息會*蛋白質(zhì)產(chǎn)品的基本信息（參見附文“蛋白質(zhì)品質(zhì)屬性”）.FDA表示,“這可能是有用的：通過使用指紋樣的分析算法（包括大量的附加屬性以及高靈敏性的組合）,研究人員在遞交的與參照的產(chǎn)品之間進(jìn)行品質(zhì)屬性的差異對比.[3]”FDA沒有定義這類蛋白質(zhì)的特定屬性以及使用方法,從一方面看,這是因為蛋白質(zhì)產(chǎn)品在特征上具有極大的多樣性.
Fiona M. Greer 稱：“指紋將取決于單個分子以及關(guān)鍵品質(zhì)的相關(guān)屬性,這可能用于規(guī)范一類特定的分子,而不是一類產(chǎn)品.例如,糖對于一類分子的功效具有重要作用,而在另一類分子中可能不重要.標(biāo)準(zhǔn)屬性應(yīng)該包括物理化學(xué)（初級和較的有序結(jié)構(gòu)）和生物學(xué)的特性.毫無疑問,該整合信息對于轉(zhuǎn)錄后修飾是需要的.”
指紋對比技術(shù)需要不斷改進(jìn).盡管真實指紋具有*性和不變性,然而很難控制蛋白質(zhì)的屬性.從蛋白產(chǎn)品來看,翻譯修飾后的改變對于蛋白質(zhì)生物活性的重要作用具有不確定性,對于培養(yǎng)的細(xì)胞,蛋白質(zhì)的異質(zhì)特征是可預(yù)料的,而生物制品的審核過程涉及到與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的討論：分段定義異質(zhì)性以及不受影響的產(chǎn)品效力和安全性.
對于仿制藥制造商而言,關(guān)鍵的一環(huán)是識別蛋白質(zhì)產(chǎn)品的變異程度,這一步驟涉及在不同時間段獲得的多批次產(chǎn)品和在多個方面評估其可行的上架期限,以及確定產(chǎn)品表現(xiàn)的一系列品質(zhì)屬性.
馬薩諸塞州生物制造中心蛋白質(zhì)科學(xué)部門主任Jin Xu說,“我不會建議挑選一個批次,并試圖制造相似性高達(dá)99%的蛋白質(zhì),這類比對蛋白質(zhì)將表現(xiàn)出一系列可接受的理化性質(zhì),生物仿制藥也屬于這一范圍.”
翻譯后修飾
糖基化能夠解釋蛋白質(zhì)較大的異質(zhì)性,這取決于蛋白質(zhì)糖基化的水平.糖單位連接到任一蛋白質(zhì)的糖基化位點上,其取決于宿主細(xì)胞類型（來自于動物、植物和微生物）.針對這一原因,FDA建議使用同種類型的細(xì)胞生產(chǎn)生物仿制藥,然而,即使在同一種培養(yǎng)的單細(xì)胞中相同的肽鏈也會出現(xiàn)不同的糖鏈結(jié)構(gòu).
由于糖基化對于蛋白質(zhì)的功效、穩(wěn)定性或免疫原性可能具有重要作用,因此,它作為一個參數(shù)需要很好地定義和控制.zui起碼確定的是蛋白質(zhì)中碳水化合物含量（中性糖、氨基糖及唾液酸）、糖鏈結(jié)構(gòu)、寡糖模式（支鏈剖面）以及多肽鏈的糖基化位點.
Pauline Rudd 稱：“聚糖在空間上具有多維度,研究人員可在一個水平上分析抗原表位,或進(jìn)行詳細(xì)的分析,這取決于蛋白質(zhì)的關(guān)鍵功能.FDA感興趣的是糖基化多樣性,它可能引起人體免疫原性.例如,植物源性蛋白中的木糖和巖藻糖.
Rudd解釋道,雖然聚糖表現(xiàn)出許多生物產(chǎn)品的關(guān)鍵功能,但是它們不是的.大約存在200個潛在的翻譯后修飾,包括C-末端剪切、二硫鍵的形成、糖基化和脫酰胺.二硫鍵在正確折疊蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用,但是半*殘基有時出現(xiàn)錯配,從而使得二硫鍵不正確地形成.他認(rèn)為,研究人員需要越來越多的水平的結(jié)構(gòu)分析（即三維結(jié)構(gòu)分析）.
正交和重疊技術(shù)
當(dāng)開發(fā)一個生物仿制藥,對理化性質(zhì)的界定不僅要確定原創(chuàng)藥的完整序列和轉(zhuǎn)錄后修飾,還要評估產(chǎn)品的品質(zhì)屬性和純度.原創(chuàng)藥和仿制藥之間側(cè)端的比較將需要來自不同技術(shù)的數(shù)據(jù),它們用于反映兩種分子的主體結(jié)構(gòu)和高度有序的結(jié)構(gòu).關(guān)于選取適當(dāng)分析方法的指導(dǎo)方針可參考ICH Q6B[5].單一方法可提供多種蛋白質(zhì)屬性的信息,例如,丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE）可提供關(guān)于體積、聚集體以及二硫鍵變異體的信息,而等電聚焦能提供同種型的信息,后者可反映糖基化或脫酰胺的差異.
準(zhǔn)確的特征策略取決于單個分子,同時還借助可比較分子大小、電荷以及結(jié)構(gòu)的方法,其中質(zhì)譜法（MS）是一種用處廣泛和重要的方法,其可提供關(guān)于完整分子量,結(jié)構(gòu)確認(rèn)（通過大規(guī)模的測繪技術(shù)）、異質(zhì)性和翻譯后修飾（包括糖基化）的信息.
過程和產(chǎn)品
對于生物制劑,影響zui終產(chǎn)品的因素有很多,如合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞類型、細(xì)胞培養(yǎng)的特定條件、以及下游加工的方法.近來,細(xì)胞培養(yǎng)條件對糖基化影響的研究發(fā)現(xiàn),幾乎所用的細(xì)胞培養(yǎng)條件都具有效果,包括細(xì)胞培養(yǎng)基的成分、溶解氧濃度、生物反應(yīng)器pH值、二氧化碳分壓、溫度、剪切應(yīng)力以及生產(chǎn)模式（即補(bǔ)料與灌注）[6] .規(guī)模擴(kuò)大也可以影響產(chǎn)品的糖基化,在工藝開發(fā)和規(guī)模擴(kuò)大時需要控制多項特征參數(shù).首先確定糖基化屬性對于蛋白質(zhì)功能起到至關(guān)重要的作用,然后選擇這些屬性*的檢測方法,而不是嘗試漫無目的方法以簡化流程[7].
比看起來的困難
雖然仿制藥可能比原創(chuàng)藥較容易,但是工程化生產(chǎn)特定仿制藥的難度不能被低估.Rudd指出,,生產(chǎn)原創(chuàng)藥要比簡單得將DNA插入到細(xì)胞系中要困難得多,研究人員期待原創(chuàng)藥能夠被忠實地復(fù)制.對于生物制劑,zui終產(chǎn)品與生物進(jìn)程緊密相關(guān),但是生物仿制藥制造商卻不知道原創(chuàng)藥的這些過程.
EMA是美國生物仿制藥的*,在2006年獲取*個批準(zhǔn)的生物仿制藥,目前已有14個生物仿制藥投放到市場上.EMA發(fā)布指導(dǎo)文件以針對不同的產(chǎn)品類型（包括epoetins、filgastrims）,以及提供關(guān)于單克隆抗體的指導(dǎo)草案[8-10].此類產(chǎn)品的具體規(guī)格無疑能夠及時獲得FDA審批,并有助于更好地界定指紋的模型
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