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技術(shù)文章

PCR-ELISA端粒酶檢測法

閱讀：449發(fā)布時(shí)間：2011-4-22

 
端粒是真核生物染色體末端的特異DNA-蛋白結(jié)構(gòu)，端粒DNA是一系列重復(fù)的富含G的DNA序列，這一序列在生物進(jìn)化中有高度的保守性（人重復(fù)序列為TTAGGG）。已確認(rèn)端粒在保護(hù)基因組DNA不被降解、防止染色體有害的結(jié)合（如染色體末端融合、重排、染色體移位和染色體缺失）中起重要作用。 
由于DNA聚合酶不能復(fù)制線性DNA的zui末端，多數(shù)正常體細(xì)胞的端粒末端每經(jīng)一個(gè)復(fù)制循環(huán)就進(jìn)行性縮短。這一現(xiàn)象在體內(nèi)和體外都得到證實(shí)，并且可能與真核生物的正常體細(xì)胞有限的繁殖能力有關(guān)。 
這一活性可能在與細(xì)胞衰老有關(guān)的情況中起作用。與體細(xì)胞相對(duì)照，生殖細(xì)胞是永生性的，它需要為將來器官形成保存全部的遺傳信息。因此它必須對(duì)抗端粒縮短。這一工作通過在基因組染色體的末端添加新的端粒重復(fù)序列而完成。 
端粒酶是一種核糖核蛋白，它們用自身的RNA成份的互補(bǔ)序列作模板，催化TTAGGG重復(fù)序列加到染色體末端。在大多數(shù)永生性細(xì)胞株和腫瘤細(xì)胞株中也可見端粒酶活性的表達(dá)。端粒酶反應(yīng)超越了細(xì)胞的增殖限制，這可能是惡性腫瘤發(fā)生的一個(gè)先決條件。 
傳統(tǒng)的端粒酶研究方法是以探針延伸為基礎(chǔ)測定端粒酶活性。由于需要大量的樣品材料，且檢驗(yàn)靈敏度受局限,這一方法已被端粒重復(fù)擴(kuò)增法（omericRepeatAmplificationProtocol,TRAP）所取代。 
標(biāo)準(zhǔn)的TRAP測定是通過PCR擴(kuò)增端粒酶反應(yīng)的產(chǎn)物，使用放射性標(biāo)記，經(jīng)凝膠電泳后，通過放射自顯影顯示結(jié)果。 
這里介紹使用非放射性標(biāo)記的檢測端粒酶的新方法：活性光密度酶聯(lián)免疫測定法。這種方法具有如下特點(diǎn)：安全，無需使用放射性同位素一步反應(yīng)，使用即用的混合物使端粒酶介導(dǎo)的引物延伸和PCR擴(kuò)增可在一個(gè)試管中進(jìn)行。應(yīng)用廣泛，擴(kuò)增后可適用于不同分析法。靈敏，與放射性同位素TRAP測定相當(dāng)?？煽?，準(zhǔn)確、重復(fù)性好。快速，6-8小時(shí)得到結(jié)果。 

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