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技術(shù)文章

小鼠雌激素（E）酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作步驟

閱讀：1397發(fā)布時(shí)間：2011-4-22

小鼠雌激素（E）試劑盒組成

　　注意事項(xiàng)
　　1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
　　2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
　　3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
　　4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔OD值的），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
　　5．嚴(yán)格按說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
　　6．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
　　7．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
　　8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
　　9．底物請(qǐng)避光保存。
　　
　　標(biāo)本處理及要求
　　1．血清、血漿標(biāo)本可直接測(cè)定；
　　2．組織：取相關(guān)組織1g于5mlPBS中勻漿，室溫孵育5小時(shí)（期間不時(shí)旋渦混合）后，2000-3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘后，取上清液待測(cè)。
　　3．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。
　　4．采集后盡早進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
　　
　　操作步驟
　　1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上按序設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在*、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；再各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后，在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉；再各取50μl分別加到第五、第六孔中；再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中；再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中；再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為36pmol/L，24pmol/L，12pmol/L，6pmol/L，3pmol/L）。
　　2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，輕輕晃動(dòng)混勻。
　　3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
　　4.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用
　　5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
　　6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
　　7.溫育：操作同3。
　　8.洗滌：操作同5。
　　9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
　　10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
　　11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
　　
　　計(jì)算
　　以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
　　
　　保存條件及有效期
　　1．試劑盒保存：；2-8℃。
　　2．有效期：6個(gè)月
　　

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